| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-19页 |
| 第一篇 氨甲酰基转移酶Asm21 的双重催化功能研究 | 第19-109页 |
| 第一章 文献综述 | 第19-38页 |
| ·氨甲酰基在次级代谢产物中的分布 | 第19-21页 |
| ·氨甲酰基与次级代谢产物生物活性的关系 | 第21-22页 |
| ·重要抗生素氨甲酰基转移酶的研究 | 第22-31页 |
| ·头霉素C（cephamycin C）氨甲酰基转移酶基因cmcH 的功能研究 | 第22-23页 |
| ·格尔登素（geldanamycin）氨甲酰基转移酶基因ge18 和gdmN 的功能研究 | 第23-25页 |
| ·默诺霉素A（moenomycin A）氨甲酰基转移酶moeM5 的功能研究 | 第25-26页 |
| ·新生霉素（novobiocin）氨甲酰基转移酶novN 的功能研究 | 第26-30页 |
| ·Asm21 与其他氨甲酰基转移酶的进化关系 | 第30-31页 |
| ·安丝菌素的生物合成途径 | 第31-36页 |
| ·安丝菌素的生物合成基因簇 | 第31-33页 |
| ·安丝菌素生物合成后修饰基因的功能研究 | 第33-35页 |
| ·极性安丝菌素衍生物（ansacarbamitocins）的发现 | 第35-36页 |
| ·本研究的内容和目的 | 第36-38页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第38-56页 |
| ·实验材料 | 第38-45页 |
| ·菌株 | 第38-40页 |
| ·质粒 | 第40-42页 |
| ·引物 | 第42-43页 |
| ·常用培养基及缓冲液 | 第43-44页 |
| ·常用抗生素 | 第44-45页 |
| ·实验方法 | 第45-56页 |
| ·大肠杆菌质粒的提取 | 第45页 |
| ·DNA 的检测 | 第45页 |
| ·限制性酶切 | 第45-46页 |
| ·DNA 片段的回收 | 第46页 |
| ·电转化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 | 第46页 |
| ·CaCl_2 法制备大肠杆菌感受态细胞及转化 | 第46-47页 |
| ·克隆的构建 | 第47-48页 |
| ·放线菌总DNA 的小量提取 | 第48页 |
| ·PCR 扩增 | 第48-49页 |
| ·大肠杆菌与放线菌的菌丝体接合转移 | 第49-50页 |
| ·菌株的小量发酵及提取 | 第50页 |
| ·突变株的大量固体发酵 | 第50页 |
| ·发酵产物的提取与产物分离 | 第50-51页 |
| ·化合物的检测 | 第51页 |
| ·化合物的结构鉴定 | 第51-52页 |
| ·突变株发酵喂养实验 | 第52页 |
| ·突变株静息细胞实验 | 第52页 |
| ·Asm21 在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第52-53页 |
| ·蛋白的SDS-PAGE 分析 | 第53页 |
| ·Asm21 酶促反应体系及检测条件 | 第53页 |
| ·HPLC 法测定标准曲线及产物的定量 | 第53-54页 |
| ·最适反应条件的确定 | 第54页 |
| ·HPLC 法测定动力学参数 | 第54-55页 |
| ·Q-TOF 法测定动力学参数 | 第55-56页 |
| 第三章 asm21 基因功能的体内研究 | 第56-70页 |
| ·突变株的构建 | 第57-60页 |
| ·含有asm21 基因的用于中断的质粒的构建 | 第57-58页 |
| ·基因asm21 的中断 | 第58-59页 |
| ·结合转移及双交换子的筛选 | 第59-60页 |
| ·突变株的回补 | 第60-65页 |
| ·pJTU832 的构建 | 第60-61页 |
| ·pJTU839 的构建 | 第61-62页 |
| ·pJTU3052 与pJTU3053 的构建 | 第62-63页 |
| ·pJTU3055 的构建 | 第63-65页 |
| ·天然片段回补质粒pJTU3050 的构建 | 第65页 |
| ·突变株的回补 | 第65页 |
| ·突变株及回补菌株的验证 | 第65-68页 |
| ·突变株的PCR 验证 | 第65页 |
| ·回补菌株的PCR 验证 | 第65-66页 |
| ·突变株及回补菌株的发酵产物检测 | 第66-68页 |
| ·讨论 | 第68-70页 |
| 第四章 突变株积累新产物的分离鉴定 | 第70-86页 |
| ·BLQ16 固体发酵产物的分离 | 第70-72页 |
| ·积累产物的分离和纯化 | 第70-72页 |
| ·积累产物的NMR 结构数据 | 第72页 |
| ·BLQ16 固体和液体发酵产物的比较 | 第72-77页 |
| ·HGF052 固体发酵产物的分离 | 第77-78页 |
| ·AGP-3 的大量制备 | 第78-84页 |
| ·PND-3 的分离纯化 | 第79-81页 |
| ·Asm25 的表达与纯化 | 第81-82页 |
| ·Asm25 的活性检测 | 第82-83页 |
| ·AGP-3 的积累及鉴定 | 第83-84页 |
| ·讨论 | 第84-86页 |
| 第五章 蛋白的表达纯化及体外活性检测 | 第86-109页 |
| ·双重催化功能的定位及体内重现 | 第86-90页 |
| ·喂养实验暗示 Asm21 负责糖苷的氨甲酰化 | 第86-88页 |
| ·静息细胞转化暗示 Asm21 负责糖苷的氨甲酰化 | 第88-90页 |
| ·蛋白表达质粒的构建 | 第90-93页 |
| ·pJTU3052 的构建 | 第90-91页 |
| ·pJTU3079 的构建 | 第91-92页 |
| ·pJTU3081 与pJTU3082 的构建 | 第92-93页 |
| ·蛋白的表达与纯化 | 第93-95页 |
| ·用于蛋白表达的质粒在E coli BLR(DE3)PLYSE 中的验证 | 第93-94页 |
| ·蛋白表达条件的摸索 | 第94-95页 |
| ·Asm21 的纯化 | 第95页 |
| ·蛋白活性的检测 | 第95-99页 |
| ·Asm21 的活性检测 | 第95-99页 |
| ·Asm21 对AGP-3 催化活性的确定 | 第99页 |
| ·Asm21 对其他底物的催化活性 | 第99页 |
| ·Asm21 的生化分析 | 第99-103页 |
| ·HPLC 标准曲线的测定及产物浓度的计算 | 第99-101页 |
| ·Asm21 最适反应温度 | 第101-102页 |
| ·Asm21 最适反应pH | 第102-103页 |
| ·Asm21 最适反应金属离子 | 第103页 |
| ·酶动力学参数的测定 | 第103-106页 |
| ·Asm21 对20-O-methyl-19-chloroproansamitocin 的催化动力学 | 第104-105页 |
| ·Asm21 对AGP-3 的催化动力学 | 第105-106页 |
| ·Asm21 对19-chloroproansamitocin 的催化动力学 | 第106页 |
| ·讨论 | 第106-109页 |
| 第二篇 抗生素生物合成基因资源的挖掘 | 第109-177页 |
| 第六章 文献综述 | 第109-119页 |
| ·安莎类抗生素的生物合成途径概述 | 第109-113页 |
| ·环醇类抗生素的生物合成途径概述 | 第113-114页 |
| ·CODEHOP 引物概述 | 第114-117页 |
| ·本研究的内容和目的 | 第117-119页 |
| 第七章 实验材料与方法 | 第119-132页 |
| ·实验材料 | 第119-126页 |
| ·菌种库菌株 | 第119-122页 |
| ·其他菌株 | 第122-123页 |
| ·阳性菌株片段测序质粒（pMD18-T） | 第123-124页 |
| ·其他质粒 | 第124-125页 |
| ·简并引物 | 第125-126页 |
| ·其他引物 | 第126页 |
| ·实验方法 | 第126-132页 |
| ·菌种的活化与基因组DNA 的提取 | 第126-127页 |
| ·PCR 扩增反应体系与体系的优化 | 第127页 |
| ·PCR 扩增反应条件与条件的优化 | 第127页 |
| ·PCR 扩增产物的电泳检测 | 第127-128页 |
| ·PCR 扩增产物的回收、克隆与序列测定 | 第128-129页 |
| ·测序结果的加工与分析 | 第129页 |
| ·CS 链霉菌基因组文库的构建与筛选 | 第129页 |
| ·限制性酶切图谱分析 | 第129页 |
| ·亚克隆的构建及末端测序 | 第129-130页 |
| ·Fosmid 测序及结果的分析 | 第130页 |
| ·CS-valA 基因突变株的构建 | 第130页 |
| ·链霉菌与大肠杆菌的双亲接合转移（孢子） | 第130-131页 |
| ·CSS 的发酵，提取与检测 | 第131-132页 |
| 第八章 菌株库的筛选 | 第132-152页 |
| ·引物的优化 | 第132-143页 |
| ·基因组总DNA 的提取 | 第132-134页 |
| ·AHBA 系列引物PCR 条件的优化及选择 | 第134-137页 |
| ·CYC 系列引物PCR 条件的优化及选择 | 第137-143页 |
| ·对放线菌菌种库的PCR 筛选 | 第143-149页 |
| ·PCR 筛选 | 第143-144页 |
| ·序列分析结果 | 第144-149页 |
| ·阳性菌株间序列相似性比较 | 第149页 |
| ·讨论 | 第149-152页 |
| 第九章 Streptomyces sp.CS 中 C7环醇基因簇的异源表达 | 第152-176页 |
| ·生物合成基因簇的获得 | 第152-164页 |
| ·文库筛选引物的设计 | 第152-153页 |
| ·文库筛选方法的确定 | 第153-154页 |
| ·文库筛选结果 | 第154页 |
| ·限制性酶切图谱分析 | 第154-156页 |
| ·亚克隆的构建及末端测序 | 第156-159页 |
| ·16H9 测序结果的分析 | 第159-164页 |
| ·基因功能的体内验证 | 第164-167页 |
| ·CS-valA 基因突变株的构建 | 第164-166页 |
| ·产物的发酵与检测 | 第166-167页 |
| ·基因簇在 S. albusJ1074 中的异源表达 | 第167-173页 |
| ·异源表达质粒pJTU3089 的构建 | 第167-168页 |
| ·异源表达菌株的PCR 验证 | 第168-169页 |
| ·异源表达菌株的发酵检测 | 第169-171页 |
| ·酯酶基因ORF22 的敲除 | 第171-172页 |
| ·pJTU3095 的异源表达 | 第172-173页 |
| ·基因簇在井冈霉素基因缺失突变株中的异源表达 | 第173-174页 |
| ·异源表达质粒pJTU3096 的构建 | 第173-174页 |
| ·pJTU3096 在井冈霉素产生菌基因缺失突变株中的异源表达 | 第174页 |
| ·讨论 | 第174-176页 |
| 第十章 总结与展望 | 第176-177页 |
| 参考文献 | 第177-194页 |
| 致谢 | 第194-197页 |
| 学术论文和科研成果 | 第197-199页 |
