| 目录 | 第1-6页 |
| 中文摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 前言 | 第10-26页 |
| 1. c-Myc促进细胞生长和增殖 | 第10-15页 |
| ·c-Myc基因与蛋白的结构 | 第10-11页 |
| ·c-Myc的下游靶基因参与多种与细胞增殖相关的生物学过程 | 第11-14页 |
| ·c-Myc促进细胞从G0/G1期进入S期 | 第12页 |
| ·c-Myc促进蛋白合成 | 第12-13页 |
| ·c-Myc促进细胞代谢 | 第13页 |
| ·c-Myc能调节microRNA的表达 | 第13-14页 |
| ·c-Myc的蛋白修饰调节其活性 | 第14-15页 |
| 2. Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶Sirt1参与肿瘤细胞增殖 | 第15-25页 |
| ·组蛋白乙酰转移酶与组蛋白去乙酰化酶的协调作用影响基因表达调控 | 第15-16页 |
| ·Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶Sirt1调节多种靶蛋白发挥功能 | 第16-19页 |
| ·Sirt1参与肿瘤细胞增殖 | 第19-23页 |
| ·Sirt1通过对组蛋白修饰的改变抑制抑癌基因的表达 | 第19-20页 |
| ·Sirt1通过去乙酰化非组蛋白抑制应激诱导的凋亡,促进细胞生存 | 第20-21页 |
| ·Sirt1在多种肿瘤细胞中呈高表达 | 第21-22页 |
| ·小分子的Sirt1抑制剂可用作抗癌药物 | 第22-23页 |
| ·Sirt1基因自身的转录调控 | 第23-25页 |
| 3. Sirt1与c-Myc之间的相互作用影响下游基因的表达及肿瘤细胞的增殖是本研究的重点 | 第25-26页 |
| 实验材料 | 第26-29页 |
| 1. 实验用细胞系、菌株和质粒和限制性内切酶 | 第26页 |
| 2. 抗体 | 第26-27页 |
| 3. 其它主要试剂及试剂盒 | 第27页 |
| 4. 主要仪器设备 | 第27-29页 |
| 实验方法 | 第29-57页 |
| 1. 细菌操作与质粒的转化 | 第29-31页 |
| ·感受态大肠杆菌DH5-α制备 | 第29页 |
| ·质粒的转化和扩增 | 第29-30页 |
| ·质粒的提取和纯化 | 第30-31页 |
| 2. 克隆构建 | 第31-32页 |
| ·c-Myc表达质粒构建 | 第31页 |
| ·c-Myc片段缺失突变质粒构建 | 第31-32页 |
| ·hSirt1-200bp启动子及点突变载体构建 | 第32页 |
| 3. 细胞培养 | 第32-34页 |
| ·细胞的生长条件 | 第32-33页 |
| ·细胞的传代 | 第33页 |
| ·细胞的复苏及冻存 | 第33-34页 |
| 4. 双荧光素酶报告系统测定启动子活性 | 第34页 |
| 5. 半定量RT-PCR | 第34-36页 |
| ·RNA提取 | 第34-35页 |
| ·逆转录PCR(RT-PCR) | 第35页 |
| ·Realtime PCR检测 | 第35-36页 |
| 6. Western Blot | 第36-39页 |
| ·细胞及组织总蛋白提取 | 第36页 |
| ·蛋白质浓度测定 | 第36页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) | 第36-37页 |
| ·抗原抗体反应 | 第37-38页 |
| ·辣根过氧化物酶化学发光法检测蛋白(ECL反应) | 第38页 |
| ·溶液配制 | 第38-39页 |
| 7. 蛋白质免疫共沉淀 | 第39-40页 |
| ·细胞裂解 | 第39页 |
| ·免疫共沉淀 | 第39-40页 |
| ·SDS-PAGE | 第40页 |
| 8. 蛋白质体外相互作用—GST pull down | 第40-42页 |
| ·原核表达载体的构建 | 第40页 |
| ·检测融合蛋白的表达 | 第40-41页 |
| ·融合蛋白的大量表达 | 第41页 |
| ·GST融合蛋白的纯化 | 第41-42页 |
| ·GST融合蛋白体外相互作用 | 第42页 |
| 9. 染色质免疫共沉淀(ChIP) | 第42-46页 |
| ·细胞固定 | 第42-43页 |
| ·细胞核的提取 | 第43页 |
| ·细胞核的裂解与超声处理 | 第43页 |
| ·超声结果的分析 | 第43页 |
| ·免疫共沉淀 | 第43-44页 |
| ·DNA的分离及纯化 | 第44页 |
| ·PCR反应 | 第44-45页 |
| ·溶液配制 | 第45-46页 |
| 10. EMSA | 第46-49页 |
| ·核蛋白提取 | 第46页 |
| ·生物素标记探针 | 第46-47页 |
| ·PAGE电泳转膜 | 第47-48页 |
| ·杂交及显影 | 第48页 |
| ·溶液配制 | 第48-49页 |
| 11. 非病毒方法介导的哺乳动物细胞转染 | 第49页 |
| ·转染用质粒DNA的大量制备 | 第49页 |
| ·阳离子转染试剂转染细胞 | 第49页 |
| 12. 腺病毒表达载体的构建、包装及靶细胞的感染 | 第49-53页 |
| ·腺病毒表达载体的构建 | 第49-52页 |
| ·腺病毒的包装及靶细胞的感染 | 第52-53页 |
| 13. 逆转录病毒的包装和靶细胞的感染 | 第53-54页 |
| ·Sirtl RNAi逆转录病毒载体的构建 | 第53页 |
| ·逆转录病毒的包装 | 第53-54页 |
| ·逆转录病毒感染靶细胞 | 第54页 |
| 14. 转染后或者逆转录病毒感染后细胞的筛选和克隆细胞株的获得 | 第54-55页 |
| ·筛选药物的配制 | 第54页 |
| ·混合克隆细胞株的获得 | 第54-55页 |
| 15. 流式细胞仪测定细胞DNA含量分析细胞周期和细胞凋亡 | 第55页 |
| ·收集并固定细胞 | 第55页 |
| ·PI染色测定细胞周期 | 第55页 |
| 16. MTT分析细胞增殖情况 | 第55-56页 |
| 17. 统计学分析 | 第56-57页 |
| 结果 | 第57-81页 |
| 1. c-Myc上调Sirt1的转录水平 | 第57-63页 |
| ·生物信息学预测Sirt1启动子区c-Myc的结合位点 | 第57页 |
| ·过表达c-Myc能在K562、MDA-MB-231、H1299细胞中上调Sirt1的表达,但是在HeLa、293A细胞中不能改变Sirt1的表达 | 第57-60页 |
| ·c-Myc能促进Sirt1启动子的转录活性 | 第60-61页 |
| ·ChIP实验验证c-Myc在Sirt1启动子区的结合 | 第61-62页 |
| ·体外EMSA实验证实c-Myc与Sirt1启动子区E-box2结合 | 第62-63页 |
| 2. Sirt1增强c-Myc的转录活性 | 第63-81页 |
| ·Sirt1与c-Myc直接结合 | 第63-67页 |
| ·Sirt1抑制c-Myc的乙酰化水平，Sirt1的抑制剂NAM促进c-Myc的乙酰化水平 | 第67-69页 |
| ·鉴定Sirt1催化的c-Myc去乙酰化位点 | 第69-70页 |
| ·Sirt1促进c-Myc对其下游报告基因的转录激活 | 第70-71页 |
| ·Sirt1对c-Myc的去乙酰化不影响c-Myc蛋白的稳定性 | 第71-72页 |
| ·Sirt1增强了c-Myc与Max的结合 | 第72-73页 |
| ·Sirt1及Ⅲ类去乙酰化酶的抑制剂NAM能够调节c-Myc下游靶基因的转录 | 第73-78页 |
| ·SirtlRNAi和NAM处理降低了c-Myc在hTERT启动子区的招募 | 第78-79页 |
| ·K562细胞中Sirt1干扰抑制细胞的增殖,引起c-Myc依赖的G1期阻滞 | 第79-81页 |
| 讨论 | 第81-90页 |
| 1. 原癌蛋白c-Myc是Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶Sirt1的底物 | 第81-83页 |
| 2. Sirt1促进c-Myc/Max二聚体的形成是促进c-Myc的转录活性的重要因素 | 第83-85页 |
| 3. c-Myc上调Sirt1的转录,可能与Sirt1形成正反馈通路 | 第85-86页 |
| 4. Sirt1与c-Myc的相互促进作用可能作为以Sirt1为核心的调控网络的一部分参与肿瘤细胞增殖 | 第86-89页 |
| 5. 本研究内容的不足和以后的研究方向 | 第89-90页 |
| 小结 | 第90-91页 |
| 参考文献 | 第91-97页 |
| 综述 | 第97-112页 |
| 参考文献 | 第105-112页 |
| 英文名词及缩写 | 第112-114页 |
| 致谢 | 第114-115页 |
| 个人简历 | 第115-116页 |
