| 中文摘要 | 第1-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第7-16页 |
| 第一章 疱疹病毒U_L26基因的研究进展 | 第16-22页 |
| 1.鸭瘟概况 | 第16-19页 |
| ·引言 | 第16页 |
| ·鸭瘟的病原学 | 第16-17页 |
| ·流行病学 | 第17-18页 |
| ·临床症状和病理变化 | 第18页 |
| ·DPV的分离与鉴定 | 第18-19页 |
| 2.疱疹病毒U_L26基因研究 | 第19-21页 |
| ·U_L26基因序列及其编码蛋白的特点 | 第19-20页 |
| ·U_L26蛋白酶的功能研究概况 | 第20页 |
| ·U_L26蛋白与其它蛋白的关系 | 第20-21页 |
| ·展望 | 第21页 |
| 3.选题目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二章 鸭瘟病毒U_L26基因分子特性的分析 | 第22-37页 |
| 1.材料与方法 | 第22-23页 |
| ·材料 | 第22页 |
| ·基因文库 | 第22页 |
| ·主要生物信息学分析软件 | 第22页 |
| ·方法 | 第22-23页 |
| ·DNA序列的测定与分析 | 第22页 |
| ·DPV U_L26基因ORF序列的确定 | 第22页 |
| ·生物信息学分析 | 第22-23页 |
| 2.结果 | 第23-33页 |
| ·DNA序列的测定与分析 | 第23页 |
| ·DPV U_L26基因及编码蛋白的生物信息学分析 | 第23-33页 |
| ·ORF(Open Reading Frame)预测 | 第23页 |
| ·采用NCBI的CDD对该2124bp的ORF进行分析 | 第23-24页 |
| ·ORF2124的氨基酸翻译和蛋白质组分分析 | 第24页 |
| ·系统进化树分析 | 第24-25页 |
| ·信号肽切割位点预测 | 第25-26页 |
| ·疏水性分析结果 | 第26页 |
| ·抗原性分析结果 | 第26-27页 |
| ·跨膜区预测结果 | 第27页 |
| ·磷酸化位点预测结果 | 第27-28页 |
| ·N-糖基化位点预测结果 | 第28-29页 |
| ·二级结构预测分析 | 第29-30页 |
| ·亚细胞定位分析 | 第30-31页 |
| ·密码子使用偏嗜性分析 | 第31-33页 |
| 3.讨论 | 第33-37页 |
| ·关于生物信息学及新基因功能的预测 | 第33-34页 |
| ·序列的生物信息学分析 | 第34-35页 |
| ·U_L26蛋白结构与功能分析 | 第35页 |
| ·U_L26序列密码子使用分析 | 第35-37页 |
| 第三章 鸭瘟病毒U_L26基因克隆、表达及多克隆抗体的制备 | 第37-62页 |
| 1.材料 | 第37-40页 |
| ·菌株/载体 | 第37页 |
| ·实验动物 | 第37页 |
| ·主要试剂及配制 | 第37-40页 |
| ·制备鸭胚成纤维细胞相关溶液 | 第37-38页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳相关溶液 | 第38页 |
| ·SDS-PAGE电泳相关溶液 | 第38页 |
| ·培养细菌所用溶液 | 第38-39页 |
| ·镍螯合琼脂糖凝胶色谱分离His标签重组可溶性蛋白溶液所用溶液 | 第39页 |
| ·弗氏佐剂 | 第39页 |
| ·Western-blot相关溶液 | 第39页 |
| ·斑点杂交相关溶液 | 第39-40页 |
| ·主要仪器设备 | 第40页 |
| ·其它 | 第40页 |
| 2.试验方法 | 第40-50页 |
| ·DPV基因组DNA提取 | 第40-41页 |
| ·制备鸭胚成纤维细胞(DEF) | 第40-41页 |
| ·DPV接种鸭胚成纤维单层细胞 | 第41页 |
| ·DPV DNA提取 | 第41页 |
| ·PCR扩增鸭瘟病毒CHv株U_L26基因 | 第41-42页 |
| ·引物设计 | 第41-42页 |
| ·U_L26基因的PCR扩增 | 第42页 |
| ·U_L26基因的T-载体克隆与鉴定 | 第42页 |
| ·U_L26基因的T-载体克隆 | 第42页 |
| ·重组质粒pMD-18-U_L26的鉴定 | 第42页 |
| ·U_L26基因重组表达菌株的构建 | 第42-44页 |
| ·重组质粒pMD18-U_L26及表达质粒pET-32a(+)的提取、酶切与回收 | 第42-43页 |
| ·酶切回收产物pET-32a(+)与U_L26片段的连接 | 第43页 |
| ·制备感受态细胞DH5α和BL21(DE3) | 第43页 |
| ·重组质粒转化感受态细胞DH5α | 第43页 |
| ·转化菌落的鉴定 | 第43-44页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第44页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及表达条件的优化 | 第44-46页 |
| ·重组表达菌株的诱导及表达 | 第44页 |
| ·重组表达蛋白SDS-PAGE电泳检测 | 第44-45页 |
| ·重组蛋白表达条件的优化 | 第45页 |
| ·Western-blotting免疫印迹检测 | 第45-46页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| ·可溶性分析 | 第46页 |
| ·纯化过柱样品的制备 | 第46-47页 |
| ·镍NTA琼脂糖凝胶柱纯化重组蛋白 | 第47页 |
| ·兔高免血清的制备 | 第47-49页 |
| ·重组蛋白疫苗的制备(免疫原的制备) | 第47-48页 |
| ·兔抗DPV U_L26高免血清的制备 | 第48页 |
| ·Western-Blotting | 第48-49页 |
| ·DNA斑点杂交检测DPV U_L26基因 | 第49-50页 |
| ·U_L26基因探针的制备 | 第49页 |
| ·斑点杂交 | 第49-50页 |
| ·琼脂扩散试验检测兔抗DPV U_L26抗体效价 | 第50页 |
| ·兔抗DPV U_L26高免血清IgG的纯化及鉴定 | 第50页 |
| ·硫酸铵沉淀法粗提取兔抗DPV U_L26 IgG | 第50页 |
| ·High-Q阴离子交换层析纯化兔抗U_L26 IgG | 第50页 |
| 3.结果 | 第50-57页 |
| ·鸭瘟病毒U_L26基因的扩增、克隆与鉴定 | 第50-51页 |
| ·重组表达质粒pET-32-U_L26的构建及鉴定 | 第51-52页 |
| ·表达质粒的重组与转化 | 第51页 |
| ·重组表达质粒pET-32-U_L26的酶切鉴定 | 第51-52页 |
| ·重组表达菌株的构建 | 第52页 |
| ·重组蛋白的诱导表达及表达条件优化 | 第52-54页 |
| ·重组蛋白的小量诱导表达 | 第52页 |
| ·IPTG浓度的优化 | 第52-53页 |
| ·诱导时间的优化 | 第53页 |
| ·诱导温度的优化 | 第53-54页 |
| ·加葡萄糖的优化 | 第54页 |
| ·重组蛋白的纯化 | 第54-55页 |
| ·Ni~+-NTA琼脂糖凝胶亲和层析纯化表达蛋白 | 第54-55页 |
| ·纯化后U_L26蛋白SDS-PAGE电泳鉴定 | 第55页 |
| ·Western-blotting检测 | 第55-56页 |
| ·斑点杂交结果 | 第56页 |
| ·兔抗DPV U_L26血清琼扩效价的检测 | 第56-57页 |
| ·兔抗DPV U_L26 IgG的纯化及SDS-PAGE鉴定 | 第57页 |
| 4.讨论 | 第57-62页 |
| ·关于表达系统及表达质粒的选择 | 第57-58页 |
| ·关于目的基因的PCR扩增及其产物的酶切 | 第58-59页 |
| ·诱导条件的优化 | 第59-60页 |
| ·IPTG的影响 | 第59页 |
| ·时间的影响 | 第59页 |
| ·温度的影响 | 第59-60页 |
| ·葡萄糖的影响 | 第60页 |
| ·U_L26蛋白的纯化 | 第60-61页 |
| ·抗血清的制备 | 第61-62页 |
| 第四章 鸭瘟强毒U_L26基因产物在宿主细胞中的表达与细胞定位 | 第62-70页 |
| 1.材料 | 第62页 |
| ·毒株/细胞 | 第62页 |
| ·主要试剂及配制 | 第62页 |
| ·主要仪器设备 | 第62页 |
| 2.实验方法 | 第62-64页 |
| ·间接免疫荧光检测DPV U_L26细胞定位方法的建立及优化 | 第62-64页 |
| ·间接免疫荧光检测DPV U_L26基因产物细胞定位方法的建立 | 第62-63页 |
| ·间接免疫荧光检测方法条件的优化 | 第63页 |
| ·特异性检测 | 第63页 |
| ·结果判定标准 | 第63-64页 |
| ·DPV U_L26基因产物细胞定位的动态监测 | 第64页 |
| 3 结果 | 第64-67页 |
| ·间接免疫荧光检测DPV U_L26细胞定位方法的建立及优化 | 第64-65页 |
| ·间接免疫荧光检测DPV U_L26基因产物细胞定位方法优化结果 | 第64-65页 |
| ·特异性试验 | 第65页 |
| ·DPV U_L26基因产物细胞定位的动态监测 | 第65-67页 |
| 4 讨论 | 第67-70页 |
| ·关于蛋白定位研究的方法 | 第67页 |
| ·病毒U_L26蛋白感染宿主细胞的定位分析 | 第67-68页 |
| ·关于U_L26蛋白在宿主细胞定位的时相分析 | 第68页 |
| ·DPV U_L26蛋白与抗病毒药物研究的初步探讨 | 第68-70页 |
| 第五章 鸭瘟病毒体外感染宿主细胞U_L26基因转录及表达时相分析 | 第70-82页 |
| 1.材料 | 第70-71页 |
| ·毒株/细胞 | 第70页 |
| ·主要试剂及仪器 | 第70-71页 |
| ·转录时相相关试剂 | 第70页 |
| ·表达时相相关试剂 | 第70-71页 |
| ·主要仪器设备 | 第71页 |
| 2.实验方法 | 第71-74页 |
| ·鸭瘟病毒体外感染宿主细胞U_L26转录时相分析 | 第71-73页 |
| ·荧光定量PCR引物的设计和合成 | 第71页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养与病毒感染 | 第71-72页 |
| ·总RNA的提取 | 第72页 |
| ·逆转录 | 第72页 |
| ·荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线的建立 | 第72页 |
| ·荧光定量PCR特异性检验U_L26基因转录时相 | 第72-73页 |
| ·统计分析 | 第73页 |
| ·鸭瘟病毒体外感染宿主细胞U_L26基因的表达时相分析 | 第73-74页 |
| ·鸭胚成纤维细胞的培养与病毒感染 | 第73页 |
| ·细胞蛋白的提取 | 第73页 |
| ·Western blot检测U_L26基因表达时相 | 第73-74页 |
| 3.结果 | 第74-77页 |
| ·鸭瘟病毒体外感染宿主细胞U_L26转录时相分析 | 第74-77页 |
| ·荧光定量PCR引物的验证 | 第74页 |
| ·荧光定量PCR反应条件优化及标准曲线的建立 | 第74-75页 |
| ·荧光定量PCR特异性检验U_L26基因转录时相 | 第75-76页 |
| ·数据统计分析 | 第76-77页 |
| ·鸭瘟病毒体外感染宿主细胞U_L26基因的表达时相分析 | 第77页 |
| 4 讨论 | 第77-82页 |
| ·关于荧光定量PCR转录时相分析 | 第78-80页 |
| ·荧光定量PCR的选择和分析基因表达量变化方法的确定 | 第78页 |
| ·关于荧光定量PCR反应 | 第78-79页 |
| ·关于UL26基因转录时相的研究 | 第79-80页 |
| ·关于Western-blot表达时相分析 | 第80-82页 |
| ·细胞总蛋白的提取 | 第80页 |
| ·合适抗体及抗体浓度的选择 | 第80页 |
| ·病毒U_L26基因表达谱分析 | 第80-82页 |
| 结论 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-88页 |
| 致谢 | 第88页 |
