| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-11页 |
| 第一章 文献综述 | 第11-23页 |
| 一、植酸酶概述 | 第11-15页 |
| 1 植酸酶的种类及其来源 | 第11页 |
| 2 植酸酶的理化性质 | 第11-12页 |
| ·植酸酶的物理性质 | 第11页 |
| ·植酸酶的催化作用及其机理 | 第11-12页 |
| ·植酸酶的生化特性 | 第12页 |
| 3 植酸酶的营养学意义 | 第12-13页 |
| 4.植酸酶酶工程 | 第13-15页 |
| ·合理设计 | 第13-14页 |
| ·半合理设计—同序概念 | 第14-15页 |
| ·非合理设计—定向进化 | 第15页 |
| 二、酶工程的新技术——酶的体外定向进化 | 第15-22页 |
| 1 突变体库构建方法 | 第17-21页 |
| ·基因突变 | 第17页 |
| ·基因重组 | 第17-18页 |
| ·结合计算机方法半理性进行定向进化 | 第18-20页 |
| ·展望 | 第20-21页 |
| 2 高通量筛选方法 | 第21-22页 |
| ·微孔板筛选 | 第21页 |
| ·展望 | 第21-22页 |
| 三、本研究的前期工作基础及目的意义 | 第22-23页 |
| 第二章 植酸酶基因工程菌酶活力高通量筛选方法的建立 | 第23-30页 |
| 一、前言 | 第23页 |
| 二、试验材料及仪器 | 第23-24页 |
| 1 菌株 | 第23页 |
| 2 主要仪器 | 第23页 |
| 3 主要试剂 | 第23页 |
| 4 培养基 | 第23-24页 |
| 5 植酸酶活性测定溶液 | 第24页 |
| 三、试验方法 | 第24-27页 |
| 1 菌种微量培养 | 第24-25页 |
| 2 酶活测定 | 第25-26页 |
| ·常规钼钒法 | 第25-26页 |
| ·微板法 | 第26页 |
| 3 两种酶活测定方法的比较分析 | 第26-27页 |
| ·稳定性 | 第26页 |
| ·最低检出值 | 第26-27页 |
| ·精确度测定 | 第27页 |
| ·线性范围 | 第27页 |
| ·测定误差分析 | 第27页 |
| 四、结果与分析 | 第27-29页 |
| 1 两种酶活测定方法的比较分析 | 第27-29页 |
| ·稳定性 | 第27-28页 |
| ·最低检出值 | 第28页 |
| ·精确度测定 | 第28页 |
| ·线性范围 | 第28页 |
| ·测定误差分析 | 第28-29页 |
| 五、讨论 | 第29-30页 |
| 第三章 通过易错PCR对植酸酶的改造研究 | 第30-52页 |
| 一、前言 | 第30页 |
| 二、试验材料及仪器 | 第30-31页 |
| 1.菌株及载体 | 第30页 |
| 2.主要仪器 | 第30-31页 |
| 3.主要试剂 | 第31页 |
| 三、试验方法 | 第31-37页 |
| 1.通过易错PCR(ep-PCR)进行植酸酶突变体库构建 | 第31-35页 |
| ·突变植酸酶基因的获得 | 第31-32页 |
| ·突变植酸酶基因pPIC9K表达载体的构建 | 第32-34页 |
| ·重组质粒pPIC9K-phyA~(ep)的电击转化 | 第34-35页 |
| 2.植酸酶突变体库的高通量筛选 | 第35-37页 |
| ·阳性转化子的微量培养 | 第35-36页 |
| ·阳性转化子的微量酶活测定 | 第36页 |
| ·突变株phyA基因拷贝数分析 | 第36页 |
| ·突变酶的SDS-PAGE分析 | 第36-37页 |
| ·突变株的遗传稳定性 | 第37页 |
| 3.突变植酸酶基因工程菌的酶学性质及序列结构分析 | 第37页 |
| ·酶学性质分析 | 第37页 |
| ·序列结构分析 | 第37页 |
| 四、结果与分析 | 第37-49页 |
| 1.通过易错PCR(ep-PCR)进行植酸酶突变体库构建 | 第37-40页 |
| ·突变植酸酶基因的获得 | 第37-39页 |
| ·突变植酸酶基因pPIC9K表达载体的构建 | 第39-40页 |
| ·重组质粒pPIC9K-phyA~(ep)的电击转化 | 第40页 |
| 2.植酸酶突变体库的高通量筛选 | 第40-42页 |
| ·筛选结果 | 第40页 |
| ·突变株phyA基因拷贝数分析 | 第40-41页 |
| ·突变酶的SDS-PAGE分析 | 第41页 |
| ·突变株的遗传稳定性 | 第41-42页 |
| 3.突变植酸酶基因工程菌的酶学性质及序列结构分析 | 第42-49页 |
| ·酶学性质分析 | 第42-43页 |
| ·序列结构分析 | 第43-49页 |
| 五、讨论 | 第49-52页 |
| 1.易错PCR条件 | 第49-50页 |
| 2.突变体文库 | 第50页 |
| 3.线性化的原因 | 第50页 |
| 4.突变植酸酶成熟蛋白结构分析 | 第50-52页 |
| 结论 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-61页 |
| 致谢 | 第61-62页 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 | 第62页 |
