| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 缩略词表 | 第8-13页 |
| 第一章 哺乳动物印记基因研究进展 | 第13-23页 |
| 1.1 印记基因的发现 | 第13-14页 |
| 1.2 印记基因的调控机制 | 第14-17页 |
| 1.3 印记基因的筛选方法 | 第17-18页 |
| 1.4 印记基因的功能作用 | 第18-22页 |
| 1.5 小结 | 第22-23页 |
| 第二章 靶向修饰H19/Igf2的CTCF结合位点DNA甲基化对小鼠胎儿成纤维细胞及小鼠胚胎干细胞的影响 | 第23-49页 |
| 1 引言 | 第23-24页 |
| 2 实验材料及方法 | 第24-34页 |
| 2.1 主要试剂 | 第24页 |
| 2.2 主要耗材及仪器 | 第24-25页 |
| 2.3 实验对象 | 第25页 |
| 2.4 小鼠胚胎成纤维细胞的获取及胚胎干细胞滋养层的制备 | 第25页 |
| 2.5 小鼠胚胎干细胞培养液 | 第25-26页 |
| 2.6 解冻细胞 | 第26页 |
| 2.7 冻存细胞 | 第26页 |
| 2.8 细胞总RNA的提取 | 第26页 |
| 2.9 实时定量PCR | 第26-28页 |
| 2.10 设计gRNA模板 | 第28-29页 |
| 2.11 靶点选择 | 第29页 |
| 2.12 SG序列退火 | 第29-30页 |
| 2.13 骨架载体pgRNA-humanized酶切线性化 | 第30-31页 |
| 2.14 骨架载体PGRNA-HUMANIZED酶切电泳琼脂糖凝胶回收 | 第31页 |
| 2.15 回收的PGRNA-HUMANIZED与 SG序列连接 | 第31-32页 |
| 2.16 转化大肠杆菌感受态(Trans-1-T1) | 第32页 |
| 2.17 载体的提取 | 第32页 |
| 2.18 CCK8 检测细胞增殖 | 第32-33页 |
| 2.19 流式细胞仪检测细胞周期实验 | 第33页 |
| 2.20 细胞转染实验 | 第33页 |
| 2.21 细胞免疫荧光染色 | 第33-34页 |
| 3 实验结果 | 第34-46页 |
| 3.1 pgRNA-humanized的验证及选择 | 第34-36页 |
| 3.2 细胞转染实验及甲基化水平检测 | 第36-39页 |
| 3.3 细胞周期实验 | 第39页 |
| 3.4 CCK8 检测细胞的增殖情况 | 第39-40页 |
| 3.5 不同靶向修饰载体共转染后对相关基因的影响 | 第40-46页 |
| 4 讨论 | 第46-49页 |
| 第三章 靶向修饰H19/IGF2的CTCF结合位点DNA甲基化对小鼠早期胚胎发育的影响 | 第49-62页 |
| 1 引言 | 第49-50页 |
| 2 实验方法 | 第50-53页 |
| 2.1 培养液的配制 | 第50-51页 |
| 2.2 体外受精(in vitro fertilization,IVF) | 第51页 |
| 2.3 胚胎RNA的提取 | 第51-52页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR | 第52页 |
| 2.5 超微灌流系统 | 第52页 |
| 2.6 输精管结扎小鼠的制备 | 第52-53页 |
| 2.7 胚胎移植 | 第53页 |
| 3 实验结果 | 第53-57页 |
| 3.1 胞浆注射靶向修饰载体CRISPR/dCas9-Dnmt3a对 Igf2 的影响 | 第53-54页 |
| 3.2 胞浆注射pgRNA-humanized-Igf2-3-1与Dnmt3a载体对CTCF结合位点甲基化的影响 | 第54页 |
| 3.3 胞浆注射后受精卵的发育率及发育形态 | 第54-55页 |
| 3.4 胞浆注射靶向修饰载体对相关基因表达的影响 | 第55-56页 |
| 3.5 对胚胎发育速度的影响 | 第56-57页 |
| 3.6 胚胎移植 | 第57页 |
| 4 讨论 | 第57-61页 |
| 5 结论 | 第61-62页 |
| 参考文献 | 第62-74页 |
| 附录 | 第74-84页 |
| 致谢 | 第84-85页 |
| 攻读学位期间已发表学术论文 | 第85页 |
