| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 第1章 绪论 | 第12-24页 |
| 1.1 生物碱简介 | 第12页 |
| 1.2 托品烷类生物碱简介 | 第12-17页 |
| 1.2.1 莨菪碱 | 第13-14页 |
| 1.2.2 6β-羟基莨菪碱 | 第14页 |
| 1.2.3 东莨菪碱 | 第14-17页 |
| 1.2.3.1 植物代谢合成东莨菪碱途径 | 第14-16页 |
| 1.2.3.2 东莨菪碱化学合成研究 | 第16页 |
| 1.2.3.3 提高植物中东莨菪碱含量的研究 | 第16-17页 |
| 1.3 莨菪碱6β-羟化酶 | 第17-20页 |
| 1.3.1 莨菪碱6β-羟化酶的催化性能 | 第18-19页 |
| 1.3.2 莨菪碱6β-羟化酶研究进展 | 第19-20页 |
| 1.4 天然产物的生物转化 | 第20-21页 |
| 1.5 代谢工程与蛋白质改造工程 | 第21-22页 |
| 1.6 本课题研究意义 | 第22页 |
| 1.7 本课题研究主要内容 | 第22-24页 |
| 第2章 莨菪碱6β-羟化酶的分子改造 | 第24-39页 |
| 2.1 引言 | 第24页 |
| 2.1.1 酶的改造 | 第24页 |
| 2.1.2 本章研究的内容及意义 | 第24页 |
| 2.2 实验材料 | 第24-26页 |
| 2.2.1 常用试剂 | 第24-25页 |
| 2.2.2 实验仪器 | 第25页 |
| 2.2.3 菌株、质粒、引物与培养基 | 第25-26页 |
| 2.3 实验方法 | 第26-31页 |
| 2.3.1 随机突变构建突变体库 | 第26-29页 |
| 2.3.1.1 酶切位点的选择 | 第27页 |
| 2.3.1.2 Mn~(2+)浓度的选择 | 第27页 |
| 2.3.1.3 基因及质粒的酶切与连接 | 第27-28页 |
| 2.3.1.4 转化 | 第28页 |
| 2.3.1.5 菌落PCR | 第28页 |
| 2.3.1.6 莨菪碱6β-羟化酶的表达 | 第28-29页 |
| 2.3.2 定点突变与定点饱和突变 | 第29页 |
| 2.3.3 筛选方法的建立 | 第29-30页 |
| 2.3.4 蛋白含量的测定 | 第30页 |
| 2.3.5 莨菪碱6β-羟化酶的分离纯化 | 第30页 |
| 2.3.6 莨菪碱6β-羟化酶羟化活力的测定 | 第30页 |
| 2.3.7 突变体同源建模与结构分析 | 第30-31页 |
| 2.4 实验结果及讨论 | 第31-38页 |
| 2.4.1 随机突变建库及筛选 | 第31-34页 |
| 2.4.1.1 易错PCR扩增莨菪碱6β-羟化酶基因 | 第31页 |
| 2.4.1.2 酶切位点的确定 | 第31-32页 |
| 2.4.1.3 Mn~(2+)浓度的确定 | 第32页 |
| 2.4.1.4 随机突变体库的筛选结果 | 第32-34页 |
| 2.4.2 定点突变建库与筛选 | 第34-37页 |
| 2.4.2.1 突变热点的确定 | 第34-35页 |
| 2.4.2.2 定点饱和突变 | 第35-36页 |
| 2.4.2.3 组合突变 | 第36-37页 |
| 2.4.3 突变体结构分析与序列比对 | 第37-38页 |
| 2.5 本章小结 | 第38-39页 |
| 第3章 莨菪碱6β-羟化酶的酶学性能表征 | 第39-51页 |
| 3.1 引言 | 第39页 |
| 3.2 实验材料 | 第39页 |
| 3.2.1 主要试剂 | 第39页 |
| 3.2.2 仪器设备 | 第39页 |
| 3.3 实验方法 | 第39-41页 |
| 3.3.1 pH对野生型与突变体AaH6H活力的影响 | 第39页 |
| 3.3.2 温度对野生型与突变体AaH6H活力的影响 | 第39-40页 |
| 3.3.3 野生型与突变体AaH6H热稳定性研究 | 第40页 |
| 3.3.4 金属离子及EDTA对AaH6H催化活力的影响 | 第40页 |
| 3.3.5 辅底物α酮戊二酸对AaH6H反应活力的影响 | 第40页 |
| 3.3.6 野生型与突变体AaH6H动力学参数的测定 | 第40-41页 |
| 3.3.7 野生型与突变体生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱的比较 | 第41页 |
| 3.3.8 野生型与突变体生长细胞转化6β-羟基莨菪碱合成东莨菪碱的比较 | 第41页 |
| 3.4 实验结果与讨论 | 第41-49页 |
| 3.4.1 pH对AaH6H活力的影响 | 第41-42页 |
| 3.4.2 温度对AaH6H活力的影响 | 第42-43页 |
| 3.4.3 AaH6H热稳定性的研究 | 第43-44页 |
| 3.4.4 金属离子及EDTA对AaH6H催化活力的影响 | 第44-45页 |
| 3.4.5 辅底物α酮戊二酸对AaH6H催化活力的影响 | 第45-46页 |
| 3.4.6 AaH6H动力学参数的测定 | 第46-47页 |
| 3.4.7 野生型与突变体生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱的比较 | 第47-48页 |
| 3.4.8 野生型与突变体生长细胞转化6β-羟基莨菪碱合成东莨菪碱的比较 | 第48-49页 |
| 3.5 本章小结 | 第49-51页 |
| 第4章 利用莨菪碱6β-羟化酶突变体制备东莨菪碱的研究 | 第51-61页 |
| 4.1 引言 | 第51页 |
| 4.2 实验材料 | 第51页 |
| 4.2.1 实验试剂 | 第51页 |
| 4.2.2 实验仪器 | 第51页 |
| 4.3 实验方法 | 第51-54页 |
| 4.3.1 诱导条件的优化 | 第51-52页 |
| 4.3.1.1 诱导温度的优化 | 第52页 |
| 4.3.1.2 诱导剂IPTG浓度的优化 | 第52页 |
| 4.3.2 利用生长细胞在摇瓶中转化莨菪碱合成东莨菪碱的研究 | 第52-53页 |
| 4.3.2.1 底物浓度的初步确定 | 第52页 |
| 4.3.2.2 转化时间的确定 | 第52-53页 |
| 4.3.3 L发酵罐生长细胞转化莨菪碱制备东莨菪碱 | 第53-54页 |
| 4.3.4 东莨菪碱分离纯化与鉴定 | 第54页 |
| 4.4 实验结果 | 第54-60页 |
| 4.4.1 诱导温度的确定 | 第54-55页 |
| 4.4.2 诱导剂浓度的确定 | 第55-56页 |
| 4.4.3 摇瓶中生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱底物加载量的确定 | 第56-57页 |
| 4.4.4 培养时间对生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱的影响 | 第57页 |
| 4.4.5 L发酵罐中生长细胞转化莨菪碱合成东莨菪碱 | 第57-59页 |
| 4.4.6 东莨菪碱分离纯化与鉴定 | 第59-60页 |
| 4.5 本章小结 | 第60-61页 |
| 结论与展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-68页 |
| 附录 | 第68-73页 |
| 硕士在读期间撰写的论文 | 第73-74页 |
| 致谢 | 第74页 |
