普鲁兰酶基因挖掘、酶学性质及结构域进化研究
| 摘要 | 第5-6页 |
| Abstract | 第6页 |
| 第1章 前言 | 第10-21页 |
| 1.1 淀粉概述 | 第10-12页 |
| 1.1.1 淀粉酶介绍 | 第10-11页 |
| 1.1.2 淀粉糖化过程中酶的作用 | 第11-12页 |
| 1.2 普鲁兰酶 | 第12-16页 |
| 1.2.1 普鲁兰酶分类和来源 | 第12-14页 |
| 1.2.2 普鲁兰酶的异源表达 | 第14-15页 |
| 1.2.3 普鲁兰酶的相关应用 | 第15-16页 |
| 1.3 枯草芽孢杆菌表达系统介绍 | 第16-17页 |
| 1.4 普鲁兰酶结构分析及进化研究 | 第17-19页 |
| 1.4.1 Ⅰ型普鲁兰酶分析 | 第17-18页 |
| 1.4.2 普鲁兰酶进化研究 | 第18-19页 |
| 1.5 课题主要内容及意义 | 第19-21页 |
| 第2章 普鲁兰酶基因分析及克隆 | 第21-42页 |
| 2.1 引言 | 第21页 |
| 2.2 材料与方法 | 第21-25页 |
| 2.2.1 菌株 | 第21页 |
| 2.2.2 培养基 | 第21-22页 |
| 2.2.3 试剂和酶 | 第22-23页 |
| 2.2.4 试剂盒和仪器 | 第23-24页 |
| 2.2.5 基因克隆PCR引物 | 第24-25页 |
| 2.3 实验方法及原理 | 第25-28页 |
| 2.3.1 原始菌株普鲁兰酶酶活验证 | 第25页 |
| 2.3.2 原始菌株在其最适温度下的生长曲线 | 第25页 |
| 2.3.3 引物设计及基因分析 | 第25页 |
| 2.3.4 基因组DNA提取及PCR | 第25-26页 |
| 2.3.5 琼脂糖凝胶电泳 | 第26-27页 |
| 2.3.6 目的产物胶回收 | 第27页 |
| 2.3.7 TA克隆 | 第27-28页 |
| 2.4 实验结果与讨论 | 第28-41页 |
| 2.4.1 原始菌普鲁兰酶酶活验证 | 第28-29页 |
| 2.4.2 原始菌生长曲线 | 第29-30页 |
| 2.4.3 普鲁兰酶基因克隆及分析 | 第30-41页 |
| 2.5 本章小结 | 第41-42页 |
| 第3章 普鲁兰酶的异源表达 | 第42-68页 |
| 3.1 引言 | 第42页 |
| 3.2 材料与方法 | 第42-48页 |
| 3.2.1 菌株与质粒 | 第42-44页 |
| 3.2.2 培养基与各种溶液 | 第44-46页 |
| 3.2.3 试剂 | 第46-47页 |
| 3.2.4 耗材和仪器 | 第47页 |
| 3.2.5 PCR引物 | 第47-48页 |
| 3.3 实验方法和步骤 | 第48-55页 |
| 3.3.1 目的基因胶回收 | 第48页 |
| 3.3.2 目的基因纯化 | 第48页 |
| 3.3.3 质粒DNA小量提取 | 第48-49页 |
| 3.3.4 酶切连接体系 | 第49页 |
| 3.3.5 大肠杆菌感受态转化 | 第49-50页 |
| 3.3.6 枯草芽孢杆菌感受态制备及其转化 | 第50页 |
| 3.3.7 菌落PCR和双酶切验证 | 第50-51页 |
| 3.3.8 SDS-PAGE凝胶 | 第51页 |
| 3.3.9 重组蛋白诱导表达 | 第51-52页 |
| 3.3.10 普鲁兰酶酶活测定方法 | 第52页 |
| 3.3.11 葡萄糖标准曲线 | 第52-53页 |
| 3.3.12 重组蛋白纯化 | 第53页 |
| 3.3.13 重组普鲁兰酶酶学性质 | 第53-55页 |
| 3.4 结果与讨论 | 第55-67页 |
| 3.4.1 重组质粒酶切验证 | 第55页 |
| 3.4.2 目的蛋白诱导表达与纯化 | 第55-60页 |
| 3.4.3 温度和pH对酶活的影响 | 第60-63页 |
| 3.4.4 化学试剂和金属离子对酶活的影响 | 第63-65页 |
| 3.4.5 重组普鲁兰酶的底物谱及终产物分析 | 第65-67页 |
| 3.5 本章小结 | 第67-68页 |
| 第4章 普鲁兰酶结构域拼接对耐热性的提高 | 第68-74页 |
| 4.1 引言 | 第68页 |
| 4.2 材料与方法 | 第68-69页 |
| 4.2.1 菌株与质粒 | 第68页 |
| 4.2.2 PCR引物 | 第68页 |
| 4.2.3 结构域拼接过程 | 第68页 |
| 4.2.4 重组菌诱导及重组蛋白的酶学性质 | 第68-69页 |
| 4.2.5 海藻酸钠包埋法固定化 | 第69页 |
| 4.3 结果与讨论 | 第69-73页 |
| 4.3.1 拼接结构域重组质粒酶切验证 | 第69页 |
| 4.3.2 重组拼接酶的诱导表达与纯化 | 第69-71页 |
| 4.3.3 酶学性质比较 | 第71-73页 |
| 4.3.4 固定化后耐热性改变 | 第73页 |
| 4.4 本章小结 | 第73-74页 |
| 第5章 总结与展望 | 第74-76页 |
| 5.1 总结 | 第74-75页 |
| 5.2 展望 | 第75-76页 |
| 参考文献 | 第76-83页 |
| 致谢 | 第83-84页 |
| 附录一 | 第84-85页 |
| 附录二 | 第85-91页 |
