| 摘要 | 第4-6页 |
| ABSTRACT | 第6-7页 |
| 第一章 前言 | 第12-25页 |
| 1.1 细胞色素P450酶系超家族 | 第12-16页 |
| 1.1.1 细胞色素P450概况 | 第12页 |
| 1.1.2 CYP450命名与分类 | 第12-13页 |
| 1.1.3 CYP450的结构与分布 | 第13-15页 |
| 1.1.4 CYP450的生物功能 | 第15-16页 |
| 1.2 CYP450羟化酶 | 第16-21页 |
| 1.2.1 CYP450羟化酶研究进展 | 第16-17页 |
| 1.2.2 CYP450羟化酶的类型 | 第17-18页 |
| 1.2.3 CYP450羟化酶催化机制 | 第18-19页 |
| 1.2.4 CYP450羟化酶辅因子循环系统 | 第19页 |
| 1.2.5 CYP450羟化酶的应用 | 第19-20页 |
| 1.2.6 CYP450羟化酶与维生素羟化 | 第20-21页 |
| 1.3 维生素D_3概况 | 第21-22页 |
| 1.3.1 VD_3的来源 | 第21页 |
| 1.3.2 1α,25(OH)_2VD_3的功能 | 第21-22页 |
| 1.3.3 活性VD_3的应用 | 第22页 |
| 1.4 活性VD_3生物转化研究进展 | 第22-23页 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 | 第23-25页 |
| 1.5.1 研究目的 | 第23-24页 |
| 1.5.2 研究意义 | 第24-25页 |
| 第二章 维生素D_3羟化酶基因的克隆及序列分析 | 第25-38页 |
| 2.1 实验材料 | 第25-27页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第25页 |
| 2.1.2 主要酶、试剂和溶液 | 第25-27页 |
| 2.1.3 培养基 | 第27页 |
| 2.1.4 主要仪器 | 第27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-33页 |
| 2.2.1 CYP维生素D羟化酶引物设计 | 第27-28页 |
| 2.2.2 总DNA的提取 | 第28-29页 |
| 2.2.3 目的基因的PCR获取 | 第29-30页 |
| 2.2.4 PCR产物的纯化 | 第30-31页 |
| 2.2.5 pMD18 T-CYPvdh克隆载体的构建 | 第31-32页 |
| 2.2.6 E. coil感受态细胞的制备 | 第32页 |
| 2.2.7 重组质粒的转化 | 第32-33页 |
| 2.2.8 转化子的筛选及验证 | 第33页 |
| 2.3 实验结果与讨论 | 第33-37页 |
| 2.3.1 总DNA的提取 | 第33-34页 |
| 2.3.2 CYPvdh的克隆 | 第34页 |
| 2.3.3 重组质粒pMD-18T-CYPvdh的构建及鉴定 | 第34-35页 |
| 2.3.4 CYPvdh生物信息学分析 | 第35-37页 |
| 2.4 小结 | 第37-38页 |
| 第三章 CYPvdh的原核表达及分离纯化 | 第38-50页 |
| 3.1 实验材料 | 第38-39页 |
| 3.1.1 菌株和质粒 | 第38页 |
| 3.1.2 主要试剂和溶液 | 第38-39页 |
| 3.1.3 仪器和设备 | 第39页 |
| 3.2 实验方法 | 第39-45页 |
| 3.2.1 质粒的提取 | 第39-40页 |
| 3.2.2 pET 30-CYPvdh表达载体的构建 | 第40-41页 |
| 3.2.3 重组表达质粒转化 | 第41-42页 |
| 3.2.4 转化子的筛选与鉴定 | 第42-43页 |
| 3.2.5 目的蛋白的诱导表达 | 第43页 |
| 3.2.6 SDS-PAGE鉴定 | 第43-45页 |
| 3.2.7 飞行质谱鉴定 | 第45页 |
| 3.2.8 目的蛋白的分离纯化 | 第45页 |
| 3.3 实验结果与讨论 | 第45-48页 |
| 3.3.1 质粒酶切 | 第45页 |
| 3.3.2 pET 30-CYPvdh重组表达载体构建 | 第45-47页 |
| 3.3.3 表达产物的SDS-PAGE分析 | 第47页 |
| 3.3.4 飞行质谱分析鉴定 | 第47-48页 |
| 3.3.5 目的蛋白的分离纯化 | 第48页 |
| 3.4 小结 | 第48-50页 |
| 第四章 维生D_3羟化酶的酶活检测 | 第50-60页 |
| 4.1 实验材料 | 第50页 |
| 4.2 实验仪器和设备 | 第50页 |
| 4.3 实验方法 | 第50-53页 |
| 4.3.1 NADPH法检测酶活 | 第50-52页 |
| 4.3.2 酶活性质分析 | 第52-53页 |
| 4.4 实验结果与讨论 | 第53-59页 |
| 4.4.1 NADPH酶活检测 | 第53-57页 |
| 4.4.2 酶学性质分析 | 第57-59页 |
| 4.5 小结 | 第59-60页 |
| 第五章 总结与展望 | 第60-62页 |
| 5.1 总结 | 第60页 |
| 5.2 问题与展望 | 第60-62页 |
| 参考文献 | 第62-69页 |
| 附录 | 第69-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 攻读硕士期间发表论文和申请专利 | 第74页 |
