| 中文摘要 | 第3-6页 |
| 英文摘要 | 第6-8页 |
| 英文缩略词表 | 第13-16页 |
| 1 引言 | 第16-22页 |
| 1.1 肝细胞癌 | 第16页 |
| 1.2 DEK基因的发现、组成及结构特征 | 第16-17页 |
| 1.3 DEK基因分布及主要功能研究 | 第17页 |
| 1.4 DEK蛋白与肿瘤研究 | 第17-18页 |
| 1.5 研究意义、目的和内容 | 第18-20页 |
| 1.5.1 研究意义 | 第18-19页 |
| 1.5.2 研究目的 | 第19页 |
| 1.5.3 研究内容 | 第19-20页 |
| 1.6 技术路线 | 第20-22页 |
| 2 实验材料 | 第22-28页 |
| 2.1 细胞培养试剂及材料 | 第22页 |
| 2.1.1 组织及细胞系 | 第22页 |
| 2.1.2 细胞培养试剂 | 第22页 |
| 2.2 动物培养 | 第22页 |
| 2.3 细菌培养试剂及材料 | 第22页 |
| 2.3.1 细菌菌株 | 第22页 |
| 2.3.2 细菌培养主要试剂 | 第22页 |
| 2.4 载体 | 第22-24页 |
| 2.4.1 重组基因穿梭表达载体 | 第22-23页 |
| 2.4.2 慢病毒表达载体 | 第23-24页 |
| 2.5 试剂及试剂盒 | 第24-27页 |
| 2.5.1 试剂盒 | 第24-25页 |
| 2.5.2 工具酶 | 第25页 |
| 2.5.3 主要溶液的配制 | 第25-27页 |
| 2.6 仪器设备 | 第27-28页 |
| 3 实验方法 | 第28-46页 |
| 3.1 肝癌细胞系的复苏、培养和冻存 | 第28-29页 |
| 3.1.1 肝癌细胞的复苏 | 第28页 |
| 3.1.2 肝癌细胞的培养 | 第28页 |
| 3.1.3 肝癌细胞的冻存 | 第28-29页 |
| 3.2 GEO和TCGA数据库分析 | 第29页 |
| 3.2.1 GEO数据分析组织中DEK基因mRNA表达水平 | 第29页 |
| 3.2.2 TCGA数据分析DEK与细胞周期、细胞迁移相关基因的皮尔逊相关系数 | 第29页 |
| 3.3 DEK基因稳定敲减细胞系的构建 | 第29-32页 |
| 3.3.1 构建shDEK慢病毒 | 第29-31页 |
| 3.3.2 构建DEK基因稳定敲减细胞系 | 第31-32页 |
| 3.4 DEK基因稳定过表达细胞系的构建 | 第32-36页 |
| 3.4.1 过表达DEK质粒的构建 | 第32-35页 |
| 3.4.2 构建DEK基因稳定过表达细胞系 | 第35-36页 |
| 3.5 半定量/荧光定量PCR检测肝癌细胞系与正常肝细胞/组织、新建细胞系中mRNA表达水平 | 第36-39页 |
| 3.5.1 总RNA的提取 | 第36-37页 |
| 3.5.2 RT-PCR合成cDNA第一条链 | 第37页 |
| 3.5.3 半定量PCR检测肝癌细胞系与正常肝细胞/组织中DEK isoform表达情况 | 第37-38页 |
| 3.5.4 RT-qPCR检测HCC细胞系与正常肝细胞/组织中相关基mRNA表达水平 | 第38-39页 |
| 3.6 Western blotting检测肝癌细胞系与正常肝细胞/组织、新建细胞系中蛋白表达水平 | 第39-40页 |
| 3.6.1 蛋白样品制备 | 第39页 |
| 3.6.2 BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定总蛋白浓度 | 第39页 |
| 3.6.3 蛋白变性 | 第39页 |
| 3.6.4 SDS-PAGE凝胶电泳 | 第39-40页 |
| 3.6.5 转膜 | 第40页 |
| 3.6.6 抗原-抗体反应 | 第40页 |
| 3.6.7 化学发光显色 | 第40页 |
| 3.7 免疫组织化学分析沉默DEK表达对脾静脉转移肝脏结节的影响 | 第40-42页 |
| 3.7.1 石蜡切片的制备 | 第40-41页 |
| 3.7.2 石蜡切片的免疫组化染色 | 第41-42页 |
| 3.8 MTS分析DEK基因敲减/过表达对细胞生长曲线的影响 | 第42页 |
| 3.9 克隆形成分析DEK基因敲减/过表达细胞系与各自对照组的参异 | 第42-43页 |
| 3.10 流式细胞检测DEK基因敲减/过表达对细胞周期的影响 | 第43页 |
| 3.11 镜检观察DEK基因敲减/过表达对细胞形态的影响 | 第43页 |
| 3.12 划痕实验分析DEK基因敲减/过表达对细胞迁移能力的影响 | 第43-44页 |
| 3.13 小鼠体内体内实验观察敲减DEK基因后对肝癌细胞生物学特性的影响 | 第44-46页 |
| 3.13.1 皮下成瘤实验 | 第44页 |
| 3.13.2 脾静脉转移实验 | 第44-46页 |
| 4 实验结果 | 第46-68页 |
| 4.1 DEK在肝癌细胞系/组织中出现过表达 | 第46-49页 |
| 4.1.1 DEK在肝癌细胞系中表达情况 | 第46页 |
| 4.1.2 DEK在肝癌组织中表达情况 | 第46-48页 |
| 4.1.3 DEK表达与肝癌病人生存率分析 | 第48-49页 |
| 4.2 DEK剪切体在肝癌细胞系/组织中表达情况 | 第49-50页 |
| 4.2.1 DEK剪切体的比较 | 第49页 |
| 4.2.2 DEK剪切体在肝癌细胞系中的表达情况 | 第49-50页 |
| 4.2.3 DEK剪切体在肝癌组织中的表达情况 | 第50页 |
| 4.3 DEK基因稳定敲减细胞系的构建 | 第50-54页 |
| 4.3.1 实时定量PCR分析慢病毒质粒敲减DEK效率 | 第50-51页 |
| 4.3.2 荧光分析慢病毒感染细胞效率 | 第51-52页 |
| 4.3.3 mRNA水平检测DEK基因敲减效率 | 第52-53页 |
| 4.3.4 蛋白水平检测DEK基因敲减效率 | 第53-54页 |
| 4.4 DEK基因稳定过表达细胞系的构建 | 第54-56页 |
| 4.4.1 重组表达质粒pcDNA3.1(+)-DEK Iso 1 和pcDNA3.1(+)-DEK Iso 2 的测序 | 第54-55页 |
| 4.4.2 mRNA水平检测DEK剪切体表达情况 | 第55-56页 |
| 4.4.3 蛋白水平检测DEK剪切体表达情况 | 第56页 |
| 4.5 DEK水平对增殖相关细胞生物学特性的影响 | 第56-62页 |
| 4.5.1 DEK水平对细胞生长曲线的影响 | 第56-57页 |
| 4.5.2 DEK水平对细胞克隆形成的影响 | 第57-58页 |
| 4.5.3 DEK水平对细胞周期的影响 | 第58-59页 |
| 4.5.4 DEK表达与其细胞周期相关基因相关性分析 | 第59-60页 |
| 4.5.5 DEK水平对细胞周期相关基因mRNA表达的影响 | 第60-62页 |
| 4.6 DEK水平对EMT相关细胞生物学特性的影响 | 第62-66页 |
| 4.6.1 DEK水平对细胞形态的影响 | 第62页 |
| 4.6.2 DEK水平对细胞迁移能力的影响 | 第62-64页 |
| 4.6.3 DEK表达与其细胞迁移相关基因相关性分析 | 第64页 |
| 4.6.4 DEK水平对EMT关键基因表达的影响 | 第64-66页 |
| 4.7 活体小鼠体内DEK水平敲减后抑制肿瘤发生和转移 | 第66-68页 |
| 4.7.1 裸鼠皮下成瘤 | 第66页 |
| 4.7.2 脾静脉转移情况 | 第66-68页 |
| 5 结论与展望 | 第68-70页 |
| 5.1 讨论 | 第68-69页 |
| 5.2 主要结论 | 第69页 |
| 5.3 后续研究工作的展望 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70-72页 |
| 参考文献 | 第72-80页 |
| 附录 | 第80页 |
| A. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文目录 | 第80页 |
| B. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目及申请专利情况 | 第80页 |
| C. 作者在攻读硕士学位期间获得奖励情况 | 第80页 |
