| 硕士学位论文评阅人、答辩委员会签名表 | 第4-5页 |
| 摘要 | 第5-7页 |
| abstract | 第7-8页 |
| 英文缩略词表 | 第14-15页 |
| 第一章 引言 | 第15-26页 |
| 1.1 巴贝斯虫概述 | 第15-18页 |
| 1.1.1 病原 | 第15页 |
| 1.1.2 生活史 | 第15-16页 |
| 1.1.3 流行病学 | 第16-18页 |
| 1.1.4 临床与病理学特征 | 第18页 |
| 1.2 巴贝斯虫病诊断方法研究进展 | 第18-23页 |
| 1.2.1 病原学诊断方法 | 第19页 |
| 1.2.2 分子生物学诊断方法 | 第19-21页 |
| 1.2.2.1 聚合酶链式反应 (PCR) | 第19-20页 |
| 1.2.2.2 实时荧光定量PCR（Real-time PCR） | 第20页 |
| 1.2.2.3 反向线状印迹（RLB） | 第20页 |
| 1.2.2.4 环介导等温扩增（LAMP） | 第20-21页 |
| 1.2.2.5 限制性内切酶片段多态性( RFLP) | 第21页 |
| 1.2.2.6 DNA探针技术 | 第21页 |
| 1.2.3 血清学诊断方法 | 第21-23页 |
| 1.2.3.1 补体结合试验（CFT） | 第21-22页 |
| 1.2.3.2 间接荧光抗体试验（IFAT） | 第22页 |
| 1.2.3.3 免疫层析技术（IC） | 第22页 |
| 1.2.3.4 乳胶凝集试验（LAT） | 第22页 |
| 1.2.3.5 酶联免疫吸附试验（ELISA） | 第22-23页 |
| 1.3 trap基因研究进展 | 第23-24页 |
| 1.3.1 trap基因的结构特征 | 第23-24页 |
| 1.3.2 TRAP家族蛋白 | 第24页 |
| 1.4 我国羊巴贝斯虫的分类研究 | 第24-25页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第25-26页 |
| 第二章 羊巴贝斯虫阳性样品的制备 | 第26-32页 |
| 2.1 材料 | 第26-27页 |
| 2.1.1 主要仪器 | 第26页 |
| 2.1.2 主要试剂 | 第26页 |
| 2.1.3 羊巴贝斯虫虫株 | 第26页 |
| 2.1.4 实验动物 | 第26-27页 |
| 2.2 方法 | 第27-28页 |
| 2.2.1 虫体繁殖 | 第27页 |
| 2.2.2 阳性血清以及基因组DNA的制备 | 第27页 |
| 2.2.3 虫种保藏和裂殖子的纯化 | 第27-28页 |
| 2.3 结果 | 第28-30页 |
| 2.3.1 阳性血清及基因组DNA的制备 | 第28页 |
| 2.3.2 裂殖子的纯化 | 第28-30页 |
| 2.4 讨论 | 第30-32页 |
| 第三章 我国羊巴贝斯虫trap基因结构及遗传进化分析 | 第32-43页 |
| 3.1 材料 | 第32-33页 |
| 3.1.1 主要仪器 | 第32页 |
| 3.1.2 主要试剂 | 第32-33页 |
| 3.2 方法 | 第33-35页 |
| 3.2.1 DNA的提取 | 第33页 |
| 3.2.2 引物的设计与合成 | 第33页 |
| 3.2.3 trap基因的PCR扩增 | 第33-34页 |
| 3.2.4 trap基因与pGEM-T Easy载体的连接与转化 | 第34页 |
| 3.2.5 羊巴贝斯虫trap基因的结构分析 | 第34页 |
| 3.2.6 trap基因序列比对 | 第34-35页 |
| 3.2.7 基于trap基因的系统发生树构建 | 第35页 |
| 3.3 结果 | 第35-40页 |
| 3.3.1 trap基因的PCR扩增 | 第35页 |
| 3.3.2 羊巴贝斯虫trap基因的结构分析 | 第35-38页 |
| 3.3.3 trap基因序列比对 | 第38-39页 |
| 3.3.4 基于trap基因的系统发生树构建 | 第39-40页 |
| 3.4 讨论 | 第40-43页 |
| 第四章 TRAP蛋白的表达及反应原性分析 | 第43-62页 |
| 4.1 材料 | 第43-44页 |
| 4.1.1 主要仪器 | 第43页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 4.1.3 血清 | 第43-44页 |
| 4.2 方法 | 第44-49页 |
| 4.2.1 总RNA的提取与单链cDNA的合成 | 第44页 |
| 4.2.2 引物的设计与合成 | 第44-45页 |
| 4.2.3 trap基因cDNA序列的PCR扩增 | 第45页 |
| 4.2.4 trap基因与pGEM-T Easy载体的连接与转化 | 第45-46页 |
| 4.2.5 生物信息学分析 | 第46页 |
| 4.2.6 trap基因表达片段的PCR扩增 | 第46-47页 |
| 4.2.7 trap基因表达片段与pGEM-T Easy载体的连接与转化 | 第47页 |
| 4.2.8 表达质粒pET-30a-LTtrap和pET-30a-XJtrap的构建 | 第47页 |
| 4.2.9 重组蛋白的诱导表达 | 第47-48页 |
| 4.2.10 重组蛋白的可溶性分析 | 第48页 |
| 4.2.11 重组蛋白的纯化 | 第48页 |
| 4.2.12 重组蛋白的质谱分析 | 第48页 |
| 4.2.13 重组蛋白的无结构区预测 | 第48页 |
| 4.2.14 用Western-blot分析重组蛋白的反应性 | 第48-49页 |
| 4.2.15 用间接ELISA方法分析重组蛋白的反应性 | 第49页 |
| 4.2.15.1 间接ELISA方法的试验程序 | 第49页 |
| 4.2.15.2 ELISA反应条件的筛选 | 第49页 |
| 4.2.15.3 重组抗原的反应性和特异性评价 | 第49页 |
| 4.3 结果 | 第49-59页 |
| 4.3.1 总RNA的提取 | 第49-50页 |
| 4.3.2 trap基因cDNA序列的PCR扩增 | 第50页 |
| 4.3.3 生物信息学分析 | 第50-51页 |
| 4.3.4 表达质粒pET-30a-LTtrap和pET-30a-XJtrap的构建 | 第51-52页 |
| 4.3.5 重组蛋白的诱导表达与纯化 | 第52-53页 |
| 4.3.6 重组蛋白的质谱分析 | 第53页 |
| 4.3.7 重组蛋白的无结构区预测 | 第53-54页 |
| 4.3.8 Western-blot对重组蛋白的反应原性分析结果 | 第54-55页 |
| 4.3.9 重组蛋白在ELISA中的反应性分析 | 第55-59页 |
| 4.3.9.1 抗原浓度的筛选结果 | 第55-56页 |
| 4.3.9.2 酶结合物工作浓度的测定 | 第56-57页 |
| 4.3.9.3 封闭液的筛选 | 第57-58页 |
| 4.3.9.4 用ELISA评价重组抗原的反应性和特异性 | 第58-59页 |
| 4.4 讨论 | 第59-62页 |
| 第五章 基于trap基因的多重PCR方法的建立 | 第62-77页 |
| 5.1 材料 | 第62-63页 |
| 5.1.1 主要仪器 | 第62页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第62-63页 |
| 5.1.3 基因组DNA | 第63页 |
| 5.2 方法 | 第63-67页 |
| 5.2.1 引物的设计 | 第63页 |
| 5.2.2 单对引物的PCR扩增 | 第63-64页 |
| 5.2.3 单对引物PCR扩增产物的序列验证 | 第64页 |
| 5.2.4 单对引物PCR的特异性 | 第64页 |
| 5.2.5 单对引物PCR的敏感性 | 第64-65页 |
| 5.2.6 多重PCR反应的建立 | 第65页 |
| 5.2.7 多重PCR扩增产物的序列验证 | 第65页 |
| 5.2.8 多重PCR反应的优化 | 第65-66页 |
| 5.2.9 多重PCR反应的特异性 | 第66页 |
| 5.2.10 多重PCR反应的敏感性 | 第66页 |
| 5.2.11 多重PCR反应的重复性 | 第66页 |
| 5.2.12 实验室样品及田间样品检测 | 第66-67页 |
| 5.3 结果 | 第67-74页 |
| 5.3.1 单对引物的PCR扩增 | 第67页 |
| 5.3.2 单对引物PCR扩增产物的序列验证 | 第67页 |
| 5.3.3 单对引物PCR的特异性 | 第67-69页 |
| 5.3.4 单对引物PCR的敏感性及引物浓度的筛选 | 第69-71页 |
| 5.3.5 多重PCR反应的建立 | 第71页 |
| 5.3.6 多重PCR扩增产物的序列验证 | 第71-72页 |
| 5.3.7 多重PCR反应的优化 | 第72页 |
| 5.3.8 多重PCR反应的特异性 | 第72-73页 |
| 5.3.9 多重PCR反应的敏感性 | 第73页 |
| 5.3.10 多重PCR反应的重复性 | 第73-74页 |
| 5.3.11 实验室样品及田间样品检测 | 第74页 |
| 5.4 讨论 | 第74-77页 |
| 第六章 全文结论 | 第77-78页 |
| 参考文献 | 第78-85页 |
| 附件1 获得的基因序列 | 第85-92页 |
| 致谢 | 第92-93页 |
| 作者简介 | 第93页 |
