| 摘要 | 第4-5页 |
| Abstract | 第5页 |
| 1 引言 | 第9-19页 |
| 1.1 nAChRs及AChBPs的特点 | 第9-11页 |
| 1.2 α-芋螺毒素的特点 | 第11-14页 |
| 1.3 α-芋螺毒素与AChBPs共结晶研究进展 | 第14-18页 |
| 1.3.1 共结晶结构揭示相互作用的重要氨基酸 | 第14-17页 |
| 1.3.2 共结晶研究发现亲和力更强的α-芋螺毒素突变体 | 第17-18页 |
| 1.4 研究目的及意义 | 第18页 |
| 1.5 技术线路 | 第18-19页 |
| 2 材料与方法 | 第19-40页 |
| 2.1 材料 | 第19-25页 |
| 2.1.1 菌株,基因及α-芋螺毒素 | 第19页 |
| 2.1.2 克隆构建 | 第19-20页 |
| 2.1.3 实验仪器及耗材 | 第20-23页 |
| 2.1.4 常用培养基及抗生素配制 | 第23页 |
| 2.1.5 试剂和缓冲液的配制 | 第23-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-40页 |
| 2.2.1 引物设计 | 第25-26页 |
| 2.2.2 PCR扩增目的片段 | 第26页 |
| 2.2.3 目的片段的酶切,胶回收与连接 | 第26-28页 |
| 2.2.4 DH5α感受态细胞制备 | 第28页 |
| 2.2.5 转化效率检测 | 第28-29页 |
| 2.2.6 连接产物与质粒转化 | 第29-30页 |
| 2.2.7 重组质粒测序 | 第30页 |
| 2.2.8 SDS-PAGE电泳分析表达蛋白 | 第30页 |
| 2.2.9 昆虫的细胞培养 | 第30-31页 |
| 2.2.10 重组Bacmid载体的构建与提取 | 第31-32页 |
| 2.2.11 重组Bacmid转染 | 第32-33页 |
| 2.2.12 重组杆状病毒的扩增 | 第33-34页 |
| 2.2.13 昆虫表达系统表达蛋白的P1检测 | 第34页 |
| 2.2.14 (分泌)蛋白表达量检测法 | 第34页 |
| 2.2.15 蛋白的胞内表达检测 | 第34页 |
| 2.2.16 昆虫表达系统表达蛋白的大量获取和纯化 | 第34-35页 |
| 2.2.17 蛋白的亲和层析(初步纯化) | 第35-36页 |
| 2.2.18 凝胶色谱纯化蛋白 | 第36页 |
| 2.2.19 重组蛋白的活性评价 | 第36页 |
| 2.2.20 蛋白的结晶 | 第36-38页 |
| 2.2.21 衍射数据的收集 | 第38-39页 |
| 2.2.22 结构解析 | 第39页 |
| 2.2.23 分子模拟 | 第39-40页 |
| 3 结果与分析 | 第40-69页 |
| 3.1 AChBPs的结构特点分析 | 第40-42页 |
| 3.2 Ac-AChBP在Bac-to-Bac系统中的表达与纯化 | 第42-53页 |
| 3.2.1 重组Ac-AChBP Bacmid的构建 | 第42页 |
| 3.2.2 重组Ac-AChBP Bacmid的转染 | 第42-45页 |
| 3.2.3 蛋白表达条件优化 | 第45-48页 |
| 3.2.4 比较胞内与胞外表达 | 第48-49页 |
| 3.2.5 Ac-AChBP的活性 | 第49-51页 |
| 3.2.6 Ls-AChBP在Bac-to-Bac系统中的表达与纯化 | 第51-53页 |
| 3.3 Ac-AChBP结晶 | 第53-57页 |
| 3.4 α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶 | 第57-62页 |
| 3.5 共结晶结构解析 | 第62-69页 |
| 3.5.1 α-芋螺毒素GIC的特点 | 第62页 |
| 3.5.2 Ac-AChBP/GIC共结晶 | 第62-64页 |
| 3.5.3 GIC与Ac-AChBP相互作用的氨基酸残基 | 第64-66页 |
| 3.5.4 计算机模拟GIC与α3β2,α4β2,α3β4 nAChRs结合 | 第66-69页 |
| 4 讨论 | 第69-72页 |
| 4.1 Ac-AChBP的高效表达 | 第69页 |
| 4.2 α-芋螺毒素与Ac-AChBP共结晶的条件 | 第69页 |
| 4.3 GIC与Ac-AChBP的共结晶结构特点 | 第69-72页 |
| 5 结论 | 第72-74页 |
| 6 参考文献 | 第74-79页 |
| 7 缩略语表 | 第79-80页 |
| 8 附录 | 第80-81页 |
| 9 致谢 | 第81页 |
