| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 英文缩写词汇及其含义说明 | 第7-14页 |
| 第一部分 引言 | 第14-22页 |
| 一、Omp85蛋白家族的研究进展 | 第14-21页 |
| 1. Omp85蛋白家族的广泛性 | 第14-16页 |
| 2. Omp85蛋白家族的结构与功能 | 第16-21页 |
| 2.1 Omp85蛋白家族的结构 | 第16-17页 |
| 2.2 Omp85蛋白家族的功能 | 第17-21页 |
| 2.2.1 参与其他β筒型蛋白的装配,整合相关蛋白质至外膜蛋白 | 第17-19页 |
| 2.2.1.1 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-细菌外膜蛋白转运机制 | 第17-18页 |
| 2.2.1.2 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-线粒体外膜蛋白转运机制 | 第18页 |
| 2.2.1.3 Omp85参与其他β筒形蛋白质的组装机制-叶绿体外膜蛋白转运机制 | 第18-19页 |
| 2.2.2 影响其他β筒形蛋白的成熟与定位,对细胞的生长、分化和存活具有重要作用 | 第19-20页 |
| 2.2.3 Omp85蛋白家族的免疫原性 | 第20-21页 |
| 3. 展望 | 第21页 |
| 二、选题目的和意义 | 第21-22页 |
| 第二部分 试验研究 | 第22-69页 |
| 1 材料 | 第23-28页 |
| 1.1 基因文库和D15氨基酸参考序列 | 第23页 |
| 1.2 实验动物和细胞株 | 第23页 |
| 1.3 载体与蛋白 | 第23-24页 |
| 1.4 菌株与血清 | 第24-25页 |
| 1.5 仪器与器材 | 第25页 |
| 1.6 主要试剂及配制 | 第25-28页 |
| 1.6.1 常规分子生物学用试剂 | 第25页 |
| 1.6.2 分析纯化学试剂 | 第25-26页 |
| 1.6.3 常用试剂的配制 | 第26-27页 |
| 1.6.4 细胞培养试剂 | 第27页 |
| 1.6.5 ELISA试验试剂 | 第27-28页 |
| 2 方法 | 第28-40页 |
| 2.1 RA D15基因的生物信息学分析 | 第28-29页 |
| 2.1.1 RA D15蛋白质的组成及其功能预测 | 第28页 |
| 2.1.2 RA D15蛋白质的抗原性分析 | 第28页 |
| 2.1.3 RA D15核苷酸序列的密码子偏爱性分析 | 第28-29页 |
| 2.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多抗制备 | 第29-33页 |
| 2.2.1 RA D15截短基因的扩增 | 第29页 |
| 2.2.1.1 RA D15截短基因引物的设计 | 第29页 |
| 2.2.1.2 RA CH-1株基因组的提取 | 第29页 |
| 2.2.1.3 RA D15截短基因的PCR扩增 | 第29页 |
| 2.2.2 PCR产物的T克隆与鉴定 | 第29-30页 |
| 2.2.2.1 PCR产物的T克隆 | 第29-30页 |
| 2.2.2.2 DH5a感受态细胞的制备 | 第30页 |
| 2.2.2.3 转化感受态细胞 | 第30页 |
| 2.2.2.4 T克隆鉴定 | 第30页 |
| 2.2.3 构建RA tD15基因的原核表达载体 | 第30-32页 |
| 2.2.3.1 重组表达载体的构建与鉴定 | 第30-31页 |
| 2.2.3.2 目的基因的诱导表达及鉴定 | 第31-32页 |
| 2.2.4 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 | 第32-33页 |
| 2.2.4.1 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体的制备 | 第32页 |
| 2.2.4.2 兔抗RA tD15重组蛋白多克隆抗体效价的测定 | 第32页 |
| 2.2.4.3 兔抗RA tD15重组蛋白IgG与RA的凝集实验 | 第32-33页 |
| 2.2.5 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的纯化和鉴定 | 第33页 |
| 2.2.5.1 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的粗提 | 第33页 |
| 2.2.5.2 阴离子交换层析法纯化兔抗重组tD15蛋白IgG | 第33页 |
| 2.2.5.3 兔抗重组tD15蛋白IgG纯度鉴定 | 第33页 |
| 2.3 检测RA的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立 | 第33-36页 |
| 2.3.1 tD15蛋白致敏乳胶试剂的制备 | 第33-34页 |
| 2.3.2 RA tD15蛋白致敏乳胶最佳条件的筛选 | 第34-35页 |
| 2.3.2.1 最佳羧化乳胶浓度的选择 | 第34页 |
| 2.3.2.2 最佳重组蛋白偶联浓度的选择 | 第34页 |
| 2.3.2.3 最佳封闭液浓度的选择 | 第34页 |
| 2.3.2.4 最佳偶联时间的选择 | 第34页 |
| 2.3.2.5 最佳的致敏缓冲液pH值的选择 | 第34-35页 |
| 2.3.2.6 偶联效率的测定 | 第35页 |
| 2.3.3 操作步骤及结果判定 | 第35页 |
| 2.3.4 致敏乳胶质量鉴定 | 第35-36页 |
| 2.3.4.1 自凝性 | 第35页 |
| 2.3.4.2 特异性 | 第35页 |
| 2.3.4.3 重复性 | 第35-36页 |
| 2.3.4.4 敏感性 | 第36页 |
| 2.3.4.5 对比试验 | 第36页 |
| 2.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 | 第36-40页 |
| 2.4.1 免疫原的制备 | 第36页 |
| 2.4.2 抗RA tD15单克隆抗体的制备 | 第36-38页 |
| 2.4.2.1 BALB/c小鼠的免疫 | 第36-37页 |
| 2.4.2.2 小鼠骨髓瘤细胞的准备 | 第37页 |
| 2.4.2.3 细胞融合及阳性杂交瘤细胞的筛选 | 第37页 |
| 2.4.2.4 杂交瘤细胞株的培养与传代.复苏与冻存 | 第37-38页 |
| 2.4.2.5 腹水单抗的制备与纯化 | 第38页 |
| 2.4.3 McAb特性鉴定 | 第38-39页 |
| 2.4.3.1 稳定性 | 第38页 |
| 2.4.3.2 单抗亚类测定 | 第38-39页 |
| 2.4.3.3 特异性 | 第39页 |
| 2.4.3.4 效价测定 | 第39页 |
| 2.4.4 单抗亲和常数的测定 | 第39页 |
| 2.4.5 单抗抗原表位的初步鉴定 | 第39-40页 |
| 3 结果 | 第40-64页 |
| 3.1 RA D15基因的生物信息学分析 | 第40-51页 |
| 3.1.1 RA D15基因序列相似性搜索结果 | 第40页 |
| 3.1.2 蛋白质的组成及其功能预测 | 第40-45页 |
| 3.1.2.1 氨基酸理化特性的分析 | 第40-42页 |
| 3.1.2.2 信号肽切割位点预测结果 | 第42页 |
| 3.1.2.3 跨膜区预测结果 | 第42页 |
| 3.1.2.4 分析蛋白功能位点预测结果 | 第42页 |
| 3.1.2.5 二级结构分析结果 | 第42页 |
| 3.1.2.6 亚细胞定位分析结果 | 第42-45页 |
| 3.1.3 蛋白质的抗原性分析 | 第45-48页 |
| 3.1.3.1 B细胞抗原表位预测 | 第45页 |
| 3.1.3.2 T细胞抗原表位预测 | 第45-48页 |
| 3.1.4 RA D15基因密码子偏爱性分析 | 第48-51页 |
| 3.1.4.1 氨基酸组成和密码子使用频率偏爱分析 | 第48页 |
| 3.1.4.2 RA D15基因稀有密码子的分析 | 第48页 |
| 3.1.4.3 RA D15基因的密码子与大肠杆菌、酵母及人的密码子偏爱性比较 | 第48-51页 |
| 3.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 | 第51-56页 |
| 3.2.1 RA D15 N端基因的扩增及其T克隆鉴定 | 第51页 |
| 3.2.2 重组表达质粒pET28a-tD15的鉴定 | 第51页 |
| 3.2.3 pET-28a(+)-tD15融合表达质粒的诱导与鉴定 | 第51-52页 |
| 3.2.4 兔抗RA tD15重组蛋白IgG特性测定 | 第52-56页 |
| 3.2.4.1 兔抗RA tD15重组蛋白IgG效价的测定 | 第52页 |
| 3.2.4.2 兔抗RA tD15重组蛋白IgG与IR A的凝集实验 | 第52页 |
| 3.2.4.3 兔抗RA tD15重组蛋白IgG的纯化 | 第52-56页 |
| 3.3 检测RA抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立 | 第56-60页 |
| 3.3.1 RA tD15蛋白致敏乳胶最佳条件的筛选 | 第56-58页 |
| 3.3.1.1 最佳羧化乳胶浓度的选择 | 第56页 |
| 3.3.1.2 最佳重组蛋白偶联浓度的选择 | 第56页 |
| 3.3.1.3 最佳封闭液浓度的选择 | 第56页 |
| 3.3.1.4 最佳偶联时间的选择 | 第56-58页 |
| 3.3.2 致敏乳胶质量鉴定 | 第58-60页 |
| 3.3.2.1 自凝性 | 第58页 |
| 3.3.2.2 特异性 | 第58-59页 |
| 3.3.2.3 重复性 | 第59页 |
| 3.3.2.4 敏感性 | 第59-60页 |
| 3.3.2.5 对比试验 | 第60页 |
| 3.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 | 第60-64页 |
| 3.4.1 免疫原的制备 | 第60-61页 |
| 3.4.2 抗RA tD15 McAb的制备 | 第61页 |
| 3.4.2.1 杂交瘤细胞株的建立与筛选 | 第61页 |
| 3.4.2.2 腹水单抗的制备与纯化 | 第61页 |
| 3.4.3 McAb特性鉴定 | 第61-63页 |
| 3.4.3.1 稳定性 | 第61-62页 |
| 3.4.3.2 抗体亚类测定 | 第62页 |
| 3.4.3.3 特异性 | 第62页 |
| 3.4.3.4 细胞培养上清及腹水效价的测定 | 第62-63页 |
| 3.4.4 单抗亲和常数的测定 | 第63页 |
| 3.4.5 单抗抗原表位的初步鉴定 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-69页 |
| 4.1 RA D15基因的生物信息学分析 | 第64-65页 |
| 4.2 RA表面抗原D15 N端基因克隆、原核表达及多克隆抗体制备 | 第65页 |
| 4.3 检测RA抗体的重组tD15蛋白乳胶凝集试验的建立 | 第65-67页 |
| 4.4 RA表面抗原tD15蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 | 第67-69页 |
| 第三部分 结论 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-76页 |
| 致谢 | 第76-77页 |
| 作者简介 | 第77页 |
