| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 第一章 绪论 | 第12-25页 |
| 1.1 半纤维素 | 第12页 |
| 1.2 木聚糖及其降解酶系 | 第12-13页 |
| 1.3 阿魏酸酯酶 | 第13-20页 |
| 1.3.1 阿魏酸酯酶和阿魏酸的定义 | 第13页 |
| 1.3.2 阿魏酸酯酶的微生物来源 | 第13-14页 |
| 1.3.3 阿魏酸酯酶的分类 | 第14页 |
| 1.3.4 阿魏酸酯酶的作用机理 | 第14-15页 |
| 1.3.5 阿魏酸酯酶活力的测定 | 第15页 |
| 1.3.6 阿魏酸酯酶的应用 | 第15-17页 |
| 1.3.7 阿魏酸酯酶的国内外研究进展 | 第17-18页 |
| 1.3.8 阿魏酸酯酶与木聚糖酶的协同作用 | 第18-19页 |
| 1.3.9 阿魏酸酯酶A的三维结构 | 第19-20页 |
| 1.4 微生物酶的热稳定性研究 | 第20-23页 |
| 1.4.1 热稳定酶的来源 | 第20页 |
| 1.4.2 影响酶热稳定性的因素 | 第20-22页 |
| 1.4.3 酶的热稳定性改造 | 第22-23页 |
| 1.5 论文的立题依据及主要研究内容 | 第23-25页 |
| 1.5.1 立题依据和研究意义 | 第23-24页 |
| 1.5.2 论文的主要研究内容 | 第24-25页 |
| 第二章 Au Fae A天然二硫键对其热稳定性的影响 | 第25-41页 |
| 2.1 引言 | 第25页 |
| 2.2 材料与方法 | 第25-32页 |
| 2.2.1 主要仪器和生产厂家 | 第25-26页 |
| 2.2.2 菌株、质粒和培养基 | 第26-27页 |
| 2.2.3 引物和试剂 | 第27页 |
| 2.2.4 主要溶液 | 第27-28页 |
| 2.2.5 主要网站及软件 | 第28页 |
| 2.2.6 重组克隆质粒的构建 | 第28-29页 |
| 2.2.7 重组表达质粒的构建 | 第29-30页 |
| 2.2.8 阿魏酸酯酶活力及蛋白质浓度的测定 | 第30页 |
| 2.2.9 阿魏酸酯酶基因在P. pastoris GS115中的表达 | 第30-31页 |
| 2.2.10 重组阿魏酸酯酶的纯化 | 第31页 |
| 2.2.11 半胱氨酸标准曲线的绘制 | 第31页 |
| 2.2.12 硫醇滴定 | 第31页 |
| 2.2.13 酶学性质的测定 | 第31-32页 |
| 2.3 结果与分析 | 第32-39页 |
| 2.3.1 Au Fae A的结构分析 | 第32-33页 |
| 2.3.2 重组克隆质粒的构建 | 第33页 |
| 2.3.3 重组表达质粒的构建 | 第33-34页 |
| 2.3.4 毕赤酵母工程菌的构建 | 第34-35页 |
| 2.3.5 重组阿魏酸酯酶的表达和纯化 | 第35页 |
| 2.3.6 半胱氨酸标准曲线 | 第35-36页 |
| 2.3.7 二硫键的测定 | 第36页 |
| 2.3.8 re Au Fae A酶学性质 | 第36-39页 |
| 2.4 本章小结 | 第39-41页 |
| 第三章 通过引入二硫键提高Au Fae A的热稳定性 | 第41-53页 |
| 3.1 引言 | 第41页 |
| 3.2 材料与方法 | 第41-43页 |
| 3.2.1 主要仪器和生产厂家 | 第41页 |
| 3.2.2 菌株、质粒和培养基 | 第41页 |
| 3.2.3 引物和试剂 | 第41-42页 |
| 3.2.4 主要溶液 | 第42页 |
| 3.2.5 主要网站及软件 | 第42页 |
| 3.2.6 二硫键的理性设计 | 第42页 |
| 3.2.7 定点突变 | 第42页 |
| 3.2.8 重组克隆质粒的构建 | 第42页 |
| 3.2.9 重组表达质粒的构建 | 第42页 |
| 3.2.10 阿魏酸酯酶活力及蛋白质浓度的测定 | 第42-43页 |
| 3.2.11 阿魏酸酯酶基因在P. pastoris GS115中的表达 | 第43页 |
| 3.2.12 重组阿魏酸酯酶的纯化 | 第43页 |
| 3.2.13 硫醇滴定 | 第43页 |
| 3.2.14 酶学性质的测定 | 第43页 |
| 3.3 结果与分析 | 第43-52页 |
| 3.3.1 拟引入二硫键位置的确定 | 第43-45页 |
| 3.3.2 定点突变 | 第45-46页 |
| 3.3.3 重组克隆质粒p UCm-T-Aufae AA126C-N152C的构建 | 第46页 |
| 3.3.4 重组表达质粒p PIC9K-Aufae AA126C-N152C的构建 | 第46-47页 |
| 3.3.5 Aufae AA126C-N152C与P. pastoris基因组的重组 | 第47页 |
| 3.3.6 re Au Fae AA126C-N152C在P. pastoris的表达与纯化 | 第47-48页 |
| 3.3.7 二硫键C126-C152的检测 | 第48页 |
| 3.3.8 re Au Fae AA126C-N152C的酶学性质 | 第48-51页 |
| 3.3.9 Au Fae AA126C-N152C热稳定机制的分析 | 第51-52页 |
| 3.4 本章小结 | 第52-53页 |
| 第四章 通过迭代饱和突变对Au Fae A的热稳定性改造 | 第53-68页 |
| 4.1 引言 | 第53页 |
| 4.2 材料与方法 | 第53-56页 |
| 4.2.1 主要仪器和生产厂家 | 第53页 |
| 4.2.2 菌株、质粒和培养基 | 第53页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第53-54页 |
| 4.2.4 主要溶液 | 第54页 |
| 4.2.5 主要网站及软件 | 第54页 |
| 4.2.6 阿魏酸酯酶活力及蛋白质浓度的测定 | 第54页 |
| 4.2.7 拟突变氨基酸位点的选择 | 第54页 |
| 4.2.8 饱和突变库的构建 | 第54-55页 |
| 4.2.9 耐热突变子的筛选 | 第55-56页 |
| 4.2.10 重组阿魏酸酯酶的纯化 | 第56页 |
| 4.2.11 酶学性质的测定 | 第56页 |
| 4.3 结果与分析 | 第56-67页 |
| 4.3.1 拟突变氨基酸位点的选择 | 第56-57页 |
| 4.3.2 耐热突变子的筛选 | 第57-63页 |
| 4.3.3 每轮最优突变子的部分酶学性质 | 第63-64页 |
| 4.3.4 S33E/N92突变子的热稳定因素分析 | 第64-65页 |
| 4.3.5 突变子热稳定性的相关讨论 | 第65-67页 |
| 4.4 本章小结 | 第67-68页 |
| 第五章 木聚糖酶Ao Xyn10B基因的克隆及表达 | 第68-83页 |
| 5.1 引言 | 第68页 |
| 5.2 材料与方法 | 第68-72页 |
| 5.2.1 主要仪器和生产厂家 | 第68页 |
| 5.2.2 菌株、质粒和培养基 | 第68-69页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第69页 |
| 5.2.4 主要溶液 | 第69页 |
| 5.2.5 主要网站及软件 | 第69页 |
| 5.2.6 米曲霉总RNA和基因组DNA的提取 | 第69页 |
| 5.2.7 引物的设计及合成 | 第69-70页 |
| 5.2.8 全长c DNA的克隆 | 第70页 |
| 5.2.9 完整DNA序列的克隆 | 第70-71页 |
| 5.2.10 重组表达质粒的构建及转化 | 第71页 |
| 5.2.11 重组木聚糖酶的表达 | 第71-72页 |
| 5.2.12 木聚糖酶酶活力测定及蛋白分析 | 第72页 |
| 5.2.13 重组木聚糖酶的纯化 | 第72页 |
| 5.2.14 酶学性质的测定 | 第72页 |
| 5.3 结果与分析 | 第72-81页 |
| 5.3.1 全长c DNA和完整DNA序列的分析 | 第72-76页 |
| 5.3.2 Ao Xyn10B一级结构分析 | 第76-78页 |
| 5.3.3 Ao Xyn10B三维结构同源建模及分析 | 第78-79页 |
| 5.3.4 重组Ao Xyn10B的表达和纯化 | 第79-80页 |
| 5.3.5 重组Ao Xyn10B的酶学性质 | 第80-81页 |
| 5.4 本章小结 | 第81-83页 |
| 第六章 Au Fae AA126C-N152C与Ao Xyn10B的共表达及协同作用 | 第83-90页 |
| 6.1 引言 | 第83页 |
| 6.2 材料与方法 | 第83-85页 |
| 6.2.1 主要仪器和生产厂家 | 第83页 |
| 6.2.2 菌株、质粒和培养基 | 第83页 |
| 6.2.3 主要引物和试剂 | 第83页 |
| 6.2.4 主要溶液 | 第83页 |
| 6.2.5 蛋白质浓度的测定 | 第83页 |
| 6.2.6 重组表达质粒的构建 | 第83-84页 |
| 6.2.7 Aufae AA126C-N152C与Aoxyn10B在毕赤酵母中的共表达 | 第84页 |
| 6.2.8 表达产物的初步分离纯化 | 第84页 |
| 6.2.9 阿魏酸酯酶和木聚糖酶活力的测定 | 第84页 |
| 6.2.10 阿魏酸酯酶与木聚糖酶的协同作用 | 第84-85页 |
| 6.3 结果与分析 | 第85-89页 |
| 6.3.1 重组表达质粒p PICZαA-Aufae AA126C-N152C的构建 | 第85页 |
| 6.3.2 酵母工程菌的PCR鉴定 | 第85-86页 |
| 6.3.3 阿魏酸酯酶和木聚糖酶的表达及蛋白分析 | 第86-87页 |
| 6.3.4 阿魏酸酯酶与木聚糖酶的协同作用 | 第87-89页 |
| 6.4 本章小结 | 第89-90页 |
| 主要结论与展望 | 第90-92页 |
| 主要结论 | 第90页 |
| 展望 | 第90-92页 |
| 论文主要创新点 | 第92-93页 |
| 致谢 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-104页 |
| 附录: 作者在攻读博士学位期间发表的论文 | 第104页 |
