| 摘要 | 第3-5页 |
| ABSTRACT | 第5-7页 |
| 符号表(缩略语表) | 第14-15页 |
| 主要仪器 | 第15-16页 |
| 第一章 文献综述 | 第16-29页 |
| 1 ACAA2基因研究进展 | 第16-19页 |
| 1.1 ACAA2基因的分布 | 第16页 |
| 1.2 ACAA2基因的作用机制 | 第16页 |
| 1.3 ACAA2基因在线粒体中的研究 | 第16-17页 |
| 1.4 ACAA2基因在肉品质中的研究 | 第17页 |
| 1.5 ACAA2基因在脂肪酸代谢中的研究 | 第17页 |
| 1.6 ACAA2基因在脂类代谢紊乱疾病中的研究 | 第17-18页 |
| 1.7 ACAA2基因在细胞凋亡中的研究 | 第18-19页 |
| 2 脂肪细胞分化的研究进展 | 第19-23页 |
| 2.1 脂肪细胞的起源 | 第19页 |
| 2.2 脂肪细胞的分类 | 第19页 |
| 2.3 前体脂肪细胞分化过程 | 第19-20页 |
| 2.4 前体脂肪细胞分化的转录调控 | 第20-22页 |
| 2.4.1 PPARγ基因对前体脂肪细胞分化的调控作用 | 第20页 |
| 2.4.2 C/EBPs在前体脂肪细胞分化的调控作用 | 第20-21页 |
| 2.4.3 AP2基因在脂肪细胞分化过程中的调控作用 | 第21页 |
| 2.4.4 FASN基因在脂肪细胞分化过程中的调控作用 | 第21页 |
| 2.4.5 与前体脂肪细胞分化相关的其它转录因子 | 第21-22页 |
| 2.5 影响前体脂肪细胞分化的因素 | 第22-23页 |
| 2.5.1 胰岛素样生长因子 | 第22页 |
| 2.5.2 肿瘤坏死因子α | 第22页 |
| 2.5.3 转化生长因子 | 第22-23页 |
| 2.5.4 前脂肪细胞因子-1 | 第23页 |
| 2.5.5 对脂肪细胞增殖分化有影响作用的其他因素 | 第23页 |
| 3 研究的目的和意义 | 第23-25页 |
| 参考文献 | 第25-29页 |
| 第二章 绵羊ACAA2基因CDS序列克隆与生物信息学分析 | 第29-41页 |
| 1 材料与方法 | 第29-33页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第29-30页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第29页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第29-30页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第30页 |
| 1.1.4 配制其他常用试剂 | 第30页 |
| 1.2 实验方法 | 第30-33页 |
| 1.2.1 PCR体外扩增ACAA2基因CDS及TA克隆 | 第30-32页 |
| 1.2.1.1 绵羊脂肪组织总RNA提取 | 第30-31页 |
| 1.2.1.2 反转录绵羊脂肪组织cDNA | 第31页 |
| 1.2.1.3 扩增目的基因CDS区 | 第31-32页 |
| 1.2.1.4 TA克隆连接及测序 | 第32页 |
| 1.2.2 绵羊AC4A2生物信息学分析 | 第32-33页 |
| 1.2.2.1 ACAA2基因序列测定与同源性分析 | 第32-33页 |
| 1.2.2.2 ACAA2蛋白理化性质预测 | 第33页 |
| 1.2.2.3 ACAA2蛋白信号肽预测 | 第33页 |
| 1.2.2.4 ACAA2蛋白亲疏水性预测 | 第33页 |
| 1.2.2.5 ACAA2蛋白磷酸化位点和糖基化位点预测 | 第33页 |
| 1.2.2.6 ACAA2蛋白亚细胞定位预测 | 第33页 |
| 1.2.2.7 ACAA2蛋白质二级结构和三级结构预测 | 第33页 |
| 1.2.2.8 ACAA2蛋白结构域预测 | 第33页 |
| 2 实验结果 | 第33-39页 |
| 2.1 ACAA2基因克隆 | 第33-34页 |
| 2.2 ACAA2基因生物信息学分析 | 第34-39页 |
| 2.2.1 ACAA2基因的同源性比较 | 第34页 |
| 2.2.2 ACAA2蛋白质的同源比较 | 第34-35页 |
| 2.2.3 ACAA2蛋白理化性质分析 | 第35页 |
| 2.2.4 ACAA2蛋白信号肽分析 | 第35-36页 |
| 2.2.5 ACAA2蛋白亲疏水性预测 | 第36页 |
| 2.2.6 ACAA2蛋白磷酸化和糖基化位点预测 | 第36-37页 |
| 2.2.7 ACAA2蛋白亚细胞定位预测 | 第37-38页 |
| 2.2.8 ACAA2蛋白二级及三级结构功能预测 | 第38页 |
| 2.2.9 ACAA2蛋白功能预测 | 第38-39页 |
| 3 讨论 | 第39页 |
| 4 小结 | 第39-40页 |
| 参考文献 | 第40-41页 |
| 第三章 ACAA2敲除载体及过表达载体构建及活性验证 | 第41-55页 |
| 1 材料与方法 | 第41-46页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第41-42页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第41页 |
| 1.1.2 主要试剂 | 第41-42页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第42页 |
| 1.2 实验方法 | 第42-46页 |
| 1.2.1 CRISPR/Cas9-ACAA2-gRNA敲除质粒构建 | 第42页 |
| 1.2.1.1 gRNA表达载体的设计和构建 | 第42页 |
| 1.2.2 pcDNA3.1-ACAA2过表达载体构建 | 第42-44页 |
| 1.2.2.1 pcDNA3.1载体酶切线性化 | 第42页 |
| 1.2.2.2 目的基因与载体连接 | 第42-43页 |
| 1.2.2.3 载体转化 | 第43页 |
| 1.2.2.4 菌液PCR检测及过表达载体酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 1.2.3 绵羊成纤维细胞(Sheep Ear Fibroblasts,SEFs)体外分离培养 | 第44-45页 |
| 1.2.3.1 组织块贴壁法分离绵羊耳样成纤维细胞 | 第44页 |
| 1.2.3.2 绵羊成纤维细胞的传代培养 | 第44-45页 |
| 1.2.3.3 绵羊成纤维细胞的冻存与复苏 | 第45页 |
| 1.2.4 ACAA2敲除载体活性验证 | 第45-46页 |
| 1.2.4.1 体外酶切活性检测gRNA靶点效率 | 第45-46页 |
| 1.2.4.2 Fugene转染绵羊成纤维细胞检测敲除效率 | 第46页 |
| 2 实验结果 | 第46-51页 |
| 2.1 敲除质粒构建 | 第46-47页 |
| 2.2 pcDNA3.1-ACAA2过表达载体构建 | 第47-48页 |
| 2.3 绵羊成纤维细胞的体外分离培养 | 第48-49页 |
| 2.4 ACAA2敲除载体活性验证 | 第49-51页 |
| 2.4.1 体外酶切活性检测gRNA靶点效率 | 第49-50页 |
| 2.4.2 敲除载体转染成纤维细胞验证敲除活性 | 第50-51页 |
| 2.4.3 T7E1酶切检测突变率 | 第51页 |
| 3 讨论 | 第51-52页 |
| 3.1 绵羊成纤维细胞的分离及传代培养 | 第51页 |
| 3.2 敲除载体转染绵羊成纤维细胞 | 第51-52页 |
| 4 小结 | 第52-53页 |
| 参考文献 | 第53-55页 |
| 第四章 ACAA2基因敲除和过表达对前体脂肪细胞分化的影响 | 第55-70页 |
| 1 材料与方法 | 第55-59页 |
| 1.1 材料与试剂 | 第55-56页 |
| 1.1.1 实验材料 | 第55页 |
| 1.1.2 主要试验试剂 | 第55页 |
| 1.1.3 主要仪器 | 第55页 |
| 1.1.4 配制其他常用试剂 | 第55-56页 |
| 1.2 实验方法 | 第56-59页 |
| 1.2.1 绵羊前体脂肪细胞的分离培养及诱导分化 | 第56-58页 |
| 1.2.1.1 绵羊前体脂肪细胞的原代培养 | 第56页 |
| 1.2.1.2 绵羊前体脂肪细胞传代培养及冻存与复苏 | 第56页 |
| 1.2.1.3 绵羊前体脂肪细胞生长曲线绘制 | 第56-57页 |
| 1.2.1.4 绵羊前体脂肪细胞的诱导分化 | 第57页 |
| 1.2.1.5 绵羊前体脂肪细胞内脂肪含量测定 | 第57页 |
| 1.2.1.6 绵羊前体脂肪细胞的分化鉴定 | 第57页 |
| 1.2.1.7 引物设计与合成、实时定量PCR | 第57-58页 |
| 1.2.2 ACAA2基因敲除和过表达对脂肪细胞分化的影响 | 第58-59页 |
| 1.2.2.1 Puro对前体脂肪细胞最小致死量的测定 | 第58页 |
| 1.2.2.2 敲除和过表达载体转染绵羊前体脂肪细胞 | 第58-59页 |
| 1.2.2.3 转染敲除和过表达载体后诱导绵羊前体脂肪细胞 | 第59页 |
| 1.2.2.4 转染敲除和过表达载体后测定前体脂肪细胞生长曲线 | 第59页 |
| 2 实验结果 | 第59-67页 |
| 2.1 绵羊前体脂肪细胞分离培养及诱导分化 | 第59-63页 |
| 2.1.1 绵羊前体脂肪细胞的原代培养 | 第59-60页 |
| 2.1.2 绵羊前体脂肪细胞生长曲线 | 第60-61页 |
| 2.1.3 绵羊前体脂肪细胞的诱导分化 | 第61页 |
| 2.1.4 绵羊前体脂肪细胞内脂肪含量测定 | 第61-62页 |
| 2.1.5 绵羊前体脂肪细胞的分化鉴定 | 第62页 |
| 2.1.6 绵羊前体脂肪细胞分化过程中标志基因表达情况 | 第62-63页 |
| 2.2 ACAA2基因的敲除和过表达对脂肪细胞分化的作用 | 第63-67页 |
| 2.2.1 Puro对前体脂肪细胞最小致死量的测定 | 第63-64页 |
| 2.2.2 敲除和过表达载体转染绵羊前体脂肪细胞 | 第64页 |
| 2.2.3 敲除和过表达ACAA2基因对脂肪细胞分化的影响 | 第64-66页 |
| 2.2.4 转染敲除和过表达载体对细胞生长曲线的影响 | 第66-67页 |
| 3 讨论 | 第67-68页 |
| 3.1 绵羊前体脂肪细胞的分离培养 | 第67-68页 |
| 3.2 绵羊前体脂肪细胞的诱导分化 | 第68页 |
| 3.3 敲除载体转染绵羊前体脂肪细胞 | 第68页 |
| 4 小结 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-70页 |
| 全文总结 | 第70-71页 |
| 致谢 | 第71-72页 |
