| 中文摘要 | 第1-11页 |
| 英文摘要 | 第11-13页 |
| 1 前言 | 第13-23页 |
| ·植物主要病毒病 | 第13-14页 |
| ·马铃薯Y病毒(PVY) | 第13页 |
| ·烟草花叶病毒（TMV） | 第13-14页 |
| ·黄瓜花叶病毒(CMV) | 第14页 |
| ·RNA沉默及植物的抗病毒研究 | 第14-21页 |
| ·基因沉默 | 第14-15页 |
| ·小干扰RNA | 第15-16页 |
| ·siRNA介导的基因沉默的作用过程 | 第16-17页 |
| ·RNA介导的病毒抗性 | 第17-18页 |
| ·RNA介导的病毒抗性的特点 | 第18页 |
| ·基于siRNA的抗病毒策略 | 第18-19页 |
| ·影响高效发夹结构的因素 | 第19-21页 |
| ·发夹结构环区域的影响 | 第20页 |
| ·发夹结构茎区域的影响 | 第20页 |
| ·核酸序列同源性的影响 | 第20-21页 |
| ·转录速度的影响 | 第21页 |
| ·本研究的目的及意义 | 第21-23页 |
| 2 材料与方法 | 第23-50页 |
| ·材料 | 第23页 |
| ·毒源 | 第23页 |
| ·供试植株 | 第23页 |
| ·菌株和质粒 | 第23页 |
| ·酶与各种生化试剂 | 第23页 |
| ·方法 | 第23-50页 |
| ·植物表达载体的构建 | 第23-25页 |
| ·烟草表达载体的构建 | 第24页 |
| ·扩增引物设计 | 第24-25页 |
| ·PCR扩增 | 第25-26页 |
| ·酶切载体和片段 | 第26页 |
| ·目的片段的回收 | 第26-27页 |
| ·目的片段与载体的连接 | 第27页 |
| ·大肠杆菌感受态的制备 | 第27-28页 |
| ·质粒DNA向大肠杆菌中转化（热激法) | 第28页 |
| ·单菌落的PCR检测 | 第28-29页 |
| ·重组质粒提取 | 第29页 |
| ·重组质粒的酶切鉴定 | 第29-30页 |
| ·质粒DNA的大量提取（碱裂解法） | 第30-31页 |
| ·克隆载体向农杆菌中转化（电激法） | 第31-32页 |
| ·农杆菌介导的烟草基因转化（叶盘法） | 第32-34页 |
| ·预培养 | 第32-33页 |
| ·共培养 | 第33页 |
| ·选择培养 | 第33-34页 |
| ·烟草总DNA的提取(CTAB法) | 第34-35页 |
| ·转基因烟草的PCR鉴定 | 第35页 |
| ·T1代转基因烟草的获得 | 第35页 |
| ·转基因烟草抗病性鉴定及ELISA检测 | 第35-37页 |
| ·转基因烟草抗病性的鉴定 | 第35页 |
| ·ELISA检测 | 第35-37页 |
| ·总RNA的Northern杂交分析 | 第37-40页 |
| ·总RNA的提取 | 第37页 |
| ·RNA电泳 | 第37-38页 |
| ·转膜 | 第38页 |
| ·制备探针 | 第38-39页 |
| ·DIG标记有效性检测 | 第39-40页 |
| ·杂交 | 第40页 |
| ·洗膜与显影 | 第40页 |
| ·siRNA的提取及杂交 | 第40-43页 |
| ·siRNA的提取 | 第41页 |
| ·siRNA电泳 | 第41-42页 |
| ·转膜 | 第42页 |
| ·探针制备 | 第42页 |
| ·siRNA杂交 | 第42页 |
| ·洗膜与显影 | 第42-43页 |
| ·Sourthern杂交分析 | 第43-48页 |
| ·烟草总DNA的提取 | 第43-44页 |
| ·烟草总DNA的酶切 | 第44页 |
| ·烟草总DNA的琼脂糖凝胶电泳 | 第44页 |
| ·转膜 | 第44-45页 |
| ·制备探针 | 第45页 |
| ·DIG标记有效性检测 | 第45-46页 |
| ·杂交 | 第46-47页 |
| ·洗膜与显色 | 第47-48页 |
| ·荧光定量PCR | 第48-50页 |
| ·烟草总RNA的提取 | 第48页 |
| ·引物设计 | 第48页 |
| ·反转录 | 第48页 |
| ·Real-Time PCR体系及反应条件 | 第48-50页 |
| 3 结果与分析 | 第50-66页 |
| ·植物表达载体的获得 | 第50-55页 |
| ·PVY、CMV和TMV的CP基因和抑制子的目的基因片段的克隆 | 第50页 |
| ·克隆载体中间片段的构建 | 第50-51页 |
| ·含正向片段和负向片段的克隆载体的构建 | 第51-54页 |
| ·表达载体pPTC-CP、pCPT-CP、pTCP-CP、pPTC-2b、pCPT-126、pTCP-HC的构建 | 第54页 |
| ·重组载体向农杆菌转化 | 第54-55页 |
| ·转基因烟草的获得 | 第55-56页 |
| ·转基因烟草的鉴定 | 第56-57页 |
| ·转基因烟草的Southern分析 | 第57-58页 |
| ·无性扩繁 | 第58页 |
| ·转基因植株的抗病性分析 | 第58-62页 |
| ·转基因植株的Northern杂交分析 | 第62-65页 |
| ·总RNA杂交分析 | 第62-63页 |
| ·siRNA杂交分析 | 第63-65页 |
| ·荧光定量PCR检测分析 | 第65-66页 |
| 4 讨论 | 第66-68页 |
| 5 结论 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 致谢 | 第74页 |