| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 缩略词 | 第12-14页 |
| 第一部分 文献综述 | 第14-34页 |
| 第一章 猪支原体肺炎和CYP3A29基因研究进展 | 第14-24页 |
| 1 猪支原体肺炎研究进展 | 第14-17页 |
| ·病原 | 第14-15页 |
| ·流行病学 | 第15页 |
| ·临床症状 | 第15页 |
| ·猪肺炎支原体的黏附与致病机理 | 第15-16页 |
| ·宿主及免疫炎症反应 | 第16-17页 |
| 2 细胞色素P450酶和CYP3A29基因研究进展 | 第17-24页 |
| ·细胞色素P450酶概述 | 第17-19页 |
| ·猪细胞色素P450酶家族 | 第19-21页 |
| ·CYP1家族 | 第19-20页 |
| ·CYP2家族 | 第20页 |
| ·CYP3家族 | 第20-21页 |
| ·CYP3A29基因研究进展 | 第21-24页 |
| ·CYP3A29基因的组织分布 | 第21页 |
| ·CYP3A29基因的表达和代谢特点 | 第21-22页 |
| ·CYP3A29基因的结构特点 | 第22-24页 |
| 第二章 相关炎性细胞因子和PPAR-γ受体 | 第24-34页 |
| 1 细胞因子与炎症反应 | 第24-30页 |
| ·肿瘤坏死因子 | 第24-26页 |
| ·白细胞介素-1 | 第26-27页 |
| ·白细胞介素-6 | 第27-29页 |
| ·白细胞介素-8 | 第29-30页 |
| 2 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR) | 第30-34页 |
| ·PPARs作用模式 | 第30-31页 |
| ·PPAR-γ相关转导途径 | 第31-32页 |
| ·PPAR-γ与炎症发生相关作用机制 | 第32-34页 |
| 第二部分 实验研究 | 第34-84页 |
| 第一章 稳定表达猪CYP3A29基因的PAM细胞系构建及鉴定 | 第34-68页 |
| 1 实验材料 | 第34-37页 |
| ·实验样品 | 第34页 |
| ·实验材料 | 第34-37页 |
| ·主要仪器设备 | 第34-35页 |
| ·主要药品、试剂及相关溶液配制 | 第35-37页 |
| ·细胞、菌种及载体 | 第37页 |
| 2 实验方法 | 第37-58页 |
| ·克隆载体的构建 | 第37-47页 |
| ·引物设计及合成 | 第39页 |
| ·肝脏总RNA提取 | 第39-40页 |
| ·RNA浓度、纯度及完整性的鉴定 | 第40页 |
| ·目的基因的反转录 | 第40-41页 |
| ·PCR扩增 | 第41-42页 |
| ·PCR产物的电泳鉴定、纯化及浓度测定 | 第42-43页 |
| ·PCR产物胶回收的片段与pMD18-T载体的连接 | 第43-44页 |
| ·转化感受态细菌 | 第44页 |
| ·阳性克隆的筛选和鉴定 | 第44-47页 |
| ·真核表达载体的构建 | 第47-51页 |
| ·目的片段和载体的制备 | 第48页 |
| ·目的片段和真核表达载体的连接 | 第48-49页 |
| ·重组质粒转化感受态细胞 | 第49页 |
| ·菌液PCR、测序验证转化效果 | 第49页 |
| ·无内毒素质粒提取 | 第49-50页 |
| ·重组真核表达载体的双酶切验证 | 第50-51页 |
| ·重组真核表达载体转染PAM细胞 | 第51-58页 |
| ·猪肺泡巨噬细胞的复苏 | 第51-52页 |
| ·猪肺泡巨噬细胞的传代 | 第52页 |
| ·猪肺泡巨噬细胞的冻存 | 第52-53页 |
| ·最佳zeocin筛选浓度的确定 | 第53-54页 |
| ·制备不同浓度的DNA-Lipofectmine-2000复合物 | 第54页 |
| ·转染PAM细胞 | 第54-55页 |
| ·zeocin抗性筛选稳定表达细胞系与扩大培养 | 第55页 |
| ·转染效果的鉴定 | 第55-57页 |
| ·稳定转染细胞的保存 | 第57-58页 |
| 3 结果 | 第58-64页 |
| ·总RNA鉴定结果 | 第58页 |
| ·猪CYP3A29基因扩增及克隆载体构建 | 第58-59页 |
| ·DNA测序结果 | 第59-61页 |
| ·真核表达质粒鉴定 | 第61-62页 |
| ·最佳zeocin筛选浓度 | 第62-63页 |
| ·RT-PCR/Western-blot检测重组细胞株CYP3A29基因的表达 | 第63-64页 |
| 4 讨论 | 第64-66页 |
| ·猪CYP3A29基因的克隆 | 第64-65页 |
| ·重组质粒转染PAM | 第65页 |
| ·猪CYP3A29高表达细胞的筛选 | 第65-66页 |
| ·转染效果的验证 | 第66页 |
| 小结 | 第66-68页 |
| 第二章 CYP3A29基因在肺炎支原体感染过程中的作用 | 第68-84页 |
| 1 实验材料 | 第68-70页 |
| ·主要仪器设备 | 第68-69页 |
| ·主要药品、试剂、耗材 | 第69-70页 |
| ·菌株和细胞 | 第70页 |
| 2 试验方法 | 第70-73页 |
| ·肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞 | 第70-71页 |
| ·肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞效果的鉴定 | 第71-72页 |
| ·细胞总RNA的提取 | 第71页 |
| ·反转录 | 第71页 |
| ·猪肺炎支原体特异性鉴定基因P36的PCR扩增 | 第71-72页 |
| ·Real-time定量PCR | 第72-73页 |
| 3 数据分析 | 第73-74页 |
| 4 实验结果 | 第74-81页 |
| ·肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞 | 第74页 |
| ·肺炎支原体感染肺泡巨噬细胞效果的PCR鉴定 | 第74-75页 |
| ·攻毒后不同处理组细胞基因水平的检测 | 第75-78页 |
| ·各处理组PPAR-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8转录水平比较 | 第78-81页 |
| 5 讨论 | 第81-84页 |
| 全文结论 | 第84-86页 |
| 参考文献 | 第86-98页 |
| 致谢 | 第98-100页 |
| 发表论文 | 第100页 |
