| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-9页 |
| 缩略语与符号语说明 | 第9-10页 |
| 第一章 文献综述 | 第10-23页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌概况 | 第10-14页 |
| ·李斯特菌分型 | 第10-11页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌的生物学特性 | 第11页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌的致病机制 | 第11-12页 |
| ·单核细胞增生李斯特菌的主要毒力因子 | 第12-14页 |
| ·p60蛋白是一种与单核细胞增生李斯特菌有关的侵染辅助蛋白 | 第14-15页 |
| ·p60蛋白具有水解肽聚糖的活性 | 第15-16页 |
| ·p60蛋白含有LysM结构域、SH3结构域和NlpC/P60家族结构域 | 第16-21页 |
| ·LysM结构域概述 | 第16-18页 |
| ·SH3结构域概述 | 第18-19页 |
| ·NlpC/P60家族结构域概述 | 第19-21页 |
| ·研究意义 | 第21-23页 |
| 第二章 材料与方法 | 第23-39页 |
| ·实验材料 | 第23-25页 |
| ·菌株、质粒与引物 | 第23-24页 |
| ·试剂与材料 | 第24-25页 |
| ·主要仪器 | 第25页 |
| ·溶液配制 | 第25-27页 |
| ·实验方法 | 第27-39页 |
| ·全长p60蛋白重组表达质粒pR60的构建 | 第27-30页 |
| ·扩增模板的制备 | 第27页 |
| ·PCR扩增目的基因片段 | 第27页 |
| ·PCR产物回收 | 第27-28页 |
| ·目的基因片段与表达载体的酶切 | 第28-29页 |
| ·目的基因片段与表达载体的连接 | 第29页 |
| ·连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 | 第29页 |
| ·细菌培养 | 第29页 |
| ·质粒抽提 | 第29-30页 |
| ·酶切筛选阳性克隆及测序鉴定 | 第30页 |
| ·p60蛋白结构域缺失体重组表达质粒的构建 | 第30-31页 |
| ·LysM1结构域缺失体重组表达质粒的构建 | 第30-31页 |
| ·N端结构域缺失体重组表达质粒的构建 | 第31页 |
| ·p60蛋白N端各结构域重组表达质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·LysM1结构域重组表达质粒的构建 | 第31页 |
| ·LysM2结构域重组表达质粒的构建 | 第31页 |
| ·LysM1-SH3结构域共存体重组表达质粒的构建 | 第31页 |
| ·SH3结构域重组表达质粒的构建 | 第31-33页 |
| ·各重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达 | 第33-35页 |
| ·小量试表达蛋白样品准备 | 第33页 |
| ·小量试表达蛋白样品处理 | 第33页 |
| ·SDS—PAGE凝胶电泳检测蛋白是否表达 | 第33-34页 |
| ·目的蛋白的大量诱导表达与镍亲和层析柱纯化 | 第34页 |
| ·Ni~(2+)-NTA agarose再生 | 第34-35页 |
| ·目的蛋白的透析 | 第35页 |
| ·目的蛋白超滤浓缩与浓度测定 | 第35页 |
| ·枯草芽孢杆菌细胞壁的提取与纯化 | 第35-36页 |
| ·从单核细胞增生细胞李斯特菌中提取蛋白质 | 第36页 |
| ·利用底物Insoluble Pulldown法鉴定蛋白结合活性 | 第36页 |
| ·利用比浊法与复性SDS-PAGE法鉴定蛋白裂解活性 | 第36-37页 |
| ·比浊法 | 第36-37页 |
| ·复性SDS-PAGE法 | 第37页 |
| ·p60蛋白最适结合条件的确定 | 第37-38页 |
| ·不同温度对p60蛋白结合活性的影响 | 第37页 |
| ·不同pH对p60蛋白结合活性的影响 | 第37页 |
| ·不同金属离子与化学组分对p60蛋白结合活性的影响 | 第37-38页 |
| ·p60蛋白底物结合特异性 | 第38页 |
| ·利用分子筛层析鉴定p60蛋白在溶液中的低聚状态 | 第38-39页 |
| 第三章 实验结果 | 第39-59页 |
| ·重组表达质粒的构建与鉴定 | 第39-42页 |
| ·重组表达质粒的原核表达与纯化 | 第42-45页 |
| ·p60蛋白及其LysM1结构域缺失体的表达与镍亲和层析柱纯化 | 第42页 |
| ·p60蛋白C端结构域的表达与镍亲和层析柱纯化 | 第42-43页 |
| ·p60蛋白LysM1结构域及LysM2结构域的表达与镍亲和层析柱纯化 | 第43-44页 |
| ·p60蛋白SH3结构域及LysMl-SH3共存体的表达与镍亲和层析柱纯化 | 第44-45页 |
| ·各重组蛋白的透析与浓缩 | 第45页 |
| ·p60蛋白N端结构域和C端结构域功能的鉴定 | 第45-49页 |
| ·p60蛋白N端两种LysM结构域的生物信息学分析 | 第49-51页 |
| ·探究LysM1结构域在整个p60蛋白中的功能意义 | 第51-53页 |
| ·p60蛋白最适结合条件的确定 | 第53-56页 |
| ·不同温度对p60蛋白结合活性的影响 | 第53-54页 |
| ·不同pH对p60蛋白结合活性的影响 | 第54-55页 |
| ·不同金属离子与化学组分对p60蛋白结合活性的影响 | 第55-56页 |
| ·p60蛋白底物结合特异性 | 第56-57页 |
| ·利用分子筛层析鉴定p60蛋白在溶液中的低聚物状态 | 第57-59页 |
| 第四章 讨论 | 第59-63页 |
| 参考文献 | 第63-74页 |
| 致谢 | 第74-75页 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 | 第75-76页 |
