| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-10页 |
| 第一章 综述 | 第10-20页 |
| 1 星斑川鲽的介绍 | 第10页 |
| 2 神经激肽B的概述 | 第10-12页 |
| ·NKB的发现和研究进展 | 第10-11页 |
| ·NKB的结构与分布 | 第11-12页 |
| ·NKB的生物学特性 | 第12页 |
| 3 NKB生理功能 | 第12-16页 |
| ·NKB对GnRH/FSH/LH分泌的调节作用 | 第12-13页 |
| ·TAC3和TAC3R基因突变对生殖功能的影响 | 第13-14页 |
| ·性类固醇激素对NKB的反馈调节作用 | 第14-15页 |
| ·NKB/kisspeptin/dynorphin神经元网络 | 第15-16页 |
| 4 研究方法与意义 | 第16-20页 |
| ·RACE技术 | 第16-17页 |
| ·3'RACE原理 | 第16-17页 |
| ·5'RACE原理 | 第17页 |
| ·在体实验 | 第17-18页 |
| ·体外细胞培养与注意事项 | 第18-19页 |
| ·研究意义 | 第19-20页 |
| 第二章 星斑川鲽Tac3基因克隆及序列分析 | 第20-38页 |
| 1 材料与方法 | 第20-28页 |
| ·实验材料 | 第20页 |
| ·实验仪器 | 第20-21页 |
| ·脑组织RNA提取 | 第21-22页 |
| ·RNA提取 | 第21页 |
| ·RNA纯度及浓度检测 | 第21-22页 |
| ·星斑川鲽Tac3基因全长cDNA克隆 | 第22-25页 |
| ·RACE引物的设计与合成 | 第22页 |
| ·3’RACE扩增Tac3基因 | 第22-24页 |
| ·5’RACE扩增Tac3基因 | 第24-25页 |
| ·琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物 | 第25-26页 |
| ·感受态细胞的制备、连接及转化 | 第26-27页 |
| ·感受态的制备 | 第26页 |
| ·目的DNA片段与pMD19-T载体的连接 | 第26-27页 |
| ·转化反应 | 第27页 |
| ·阳性克隆的筛选 | 第27页 |
| ·Tac3基因cDNA的全长验证 | 第27-28页 |
| ·序列拼接和分析 | 第28页 |
| 2. 实验结果 | 第28-36页 |
| ·总RNA质量鉴定 | 第28-29页 |
| ·Tac3基因 3’和 5’末端的扩增与克隆 | 第29-30页 |
| ·Tac3基因序列分析 | 第30-36页 |
| ·氨基酸基本理化特征 | 第31页 |
| ·蛋白质信号肽预测结果 | 第31-32页 |
| ·氨基酸疏水性分析结果 | 第32页 |
| ·蛋白质跨膜区域预测结果 | 第32-33页 |
| ·蛋白质二级结构的预测 | 第33-34页 |
| ·蛋白质三级结构的预测 | 第34页 |
| ·同源性和进化分析 | 第34-36页 |
| 3 讨论 | 第36-38页 |
| ·RACE技术 | 第36-37页 |
| ·序列分析 | 第37-38页 |
| 第三章 NKB原核载体的构建及重组表达 | 第38-48页 |
| 1 实验材料试剂 | 第38页 |
| ·实验菌种 | 第38页 |
| ·实验试剂 | 第38页 |
| 2 实验方法 | 第38-43页 |
| ·星斑川鲽NKB前体蛋白引物设计 | 第38页 |
| ·NKB开放阅读框序列扩增 | 第38-39页 |
| ·原核表达载体构建 | 第39-41页 |
| ·提取质粒 | 第39-40页 |
| ·质粒双酶切 | 第40-41页 |
| ·表达载体pET-21a与目的片段连接 | 第41页 |
| ·转化测序 | 第41页 |
| ·IPTG诱导E.coli BL21菌株表达NKB前体蛋白 | 第41-42页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第42-43页 |
| ·聚丙烯酰胺凝胶的配方 | 第42页 |
| ·SDS-PAGE试剂的配制 | 第42-43页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第43页 |
| 3 实验结果 | 第43-46页 |
| ·pMD19-T/NKB质粒的克隆 | 第43-44页 |
| ·pET-21a质粒的双酶切 | 第44-45页 |
| ·pET-21a/NKB重组质粒的双酶切验证 | 第45页 |
| ·pET-21a/NKB重组子序列测定与分析 | 第45页 |
| ·SDS-RAGE电泳检验 | 第45-46页 |
| 4 讨论 | 第46-48页 |
| 第四章 Tac3基因组织表达与生殖周期表达模式分析 | 第48-57页 |
| 1 材料和方法 | 第48-51页 |
| ·实验材料 | 第48页 |
| ·实验试剂 | 第48页 |
| ·实验仪器 | 第48-49页 |
| ·总RNA提取 | 第49页 |
| ·荧光定量PCR cDNA制备 | 第49页 |
| ·荧光定量PCR引物设计 | 第49-50页 |
| ·引物设计原则 | 第49-50页 |
| ·引物设计 | 第50页 |
| ·内参基因的选择原则 | 第50-51页 |
| ·荧光定量PCR | 第51页 |
| ·数据统计与分析 | 第51页 |
| 2 结果与分析 | 第51-55页 |
| ·提取RNA的相关数据 | 第51-52页 |
| ·标准曲线的建立 | 第52页 |
| ·扩增曲线与溶解曲线 | 第52-53页 |
| ·Tac3 mRNA组织特异性分析 | 第53-54页 |
| ·Tac3 mNRA在不同生殖周期的表达情况 | 第54-55页 |
| 3 讨论 | 第55-57页 |
| ·荧光定量PCR | 第55页 |
| ·Tac3基因表达特性研究 | 第55-57页 |
| 第五章 NKB在生殖过程中功能研究 | 第57-66页 |
| 1 材料与方法 | 第57-60页 |
| ·实验动物 | 第57页 |
| ·实验试剂 | 第57-58页 |
| ·实验器材 | 第58页 |
| ·实验方法 | 第58-59页 |
| ·在体注射实验 | 第58页 |
| ·脑细胞处理 | 第58-59页 |
| ·NKB多肽离体实验 | 第59页 |
| ·荧光定量PCR cDNA模板制备 | 第59页 |
| ·荧光定量PCR引物设计 | 第59页 |
| ·荧光定量PCR | 第59-60页 |
| ·数据处理 | 第60页 |
| 2 结果 | 第60-65页 |
| ·标准曲线的建立 | 第60页 |
| ·NKB对GnRH、FSH、LH等基因表达影响 | 第60-64页 |
| ·在体注射 | 第60-62页 |
| ·离体细胞培养 | 第62-64页 |
| ·雌二醇对Tac3 mRNA表达的调控分析 | 第64-65页 |
| 3 讨论 | 第65-66页 |
| ·NKB功能研究 | 第65-66页 |
| 结论 | 第66-67页 |
| 参考文献 | 第67-76页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第76-79页 |
| 致谢 | 第79页 |
