| 摘要 | 第1-6页 |
| Abstract | 第6-13页 |
| 本论文的创新点 | 第13页 |
| 一、文献概述 | 第13-26页 |
| (一) 传统化石燃料与生物柴油 | 第13-14页 |
| (二) 生物柴油与油脂原料 | 第14-15页 |
| (三) 生物柴油与微藻产油 | 第15-19页 |
| 1、微藻生产生物柴油的历史沿节 | 第15-16页 |
| 2、微藻产油的技术环节 | 第16-19页 |
| ·、理想藻种的选育 | 第16-17页 |
| ·、产油微藻的培养条件 | 第17-18页 |
| ·、培养方式对油脂积累的影响 | 第18页 |
| ·、产汕微藻培养技术的改良 | 第18-19页 |
| (四) 二酰基甘油酰基转移酶:一个催产合成三酰甘油的关键酶素 | 第19-24页 |
| 1、DGAT2基因的发现 | 第20页 |
| 2、DGAT2基因的结构 | 第20-23页 |
| 3、DGAT的亚细胞定位 | 第23页 |
| 4、DGAT的功能 | 第23-24页 |
| (五) 基因沉默、过量表达与亚细胞定位 | 第24-25页 |
| 1、RNAi的发现 | 第24页 |
| 2、RNAi的机制 | 第24-25页 |
| 3、RNAi在微藻性状改良中的应用 | 第25页 |
| (六) 本研究的目的意义 | 第25-26页 |
| 二、微藻产油策略一:微藻选育和营养盐限制培养 | 第26-39页 |
| (一) 材料与方法 | 第26-32页 |
| ·、培养基 | 第26-28页 |
| ·、仪器 | 第28页 |
| ·、藻种的采集和分离纯化 | 第28页 |
| ·、藻株、菌株的培养条件 | 第28-29页 |
| ·、生物量、细胞干重、水溶蛋白、总糖统计和中性脂的观测 | 第29-30页 |
| ·、生物量的统计 | 第29页 |
| ·、微藻干重的测量 | 第29页 |
| ·、水溶蛋白的测量 | 第29页 |
| ·、总糖测定 | 第29-30页 |
| ·、使用尼罗红荧光法计算中性脂含量 | 第30页 |
| ·、Y-002的18S rDNA基因克隆及序列分析 | 第30-32页 |
| ·、降落PCR | 第30-31页 |
| ·、大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备 | 第31页 |
| ·、重组质粒构建 | 第31页 |
| ·、热激转化重组质粒 | 第31-32页 |
| ·、同源比对 | 第32页 |
| ·、营养盐限制培养下Y-002生长周期和中性脂积累的观测 | 第32页 |
| ·、TrAP,HSM,SE和BG11的氮、铁、磷、硫、钾、镁和钙限制培养 | 第32页 |
| ·、低碳培养基在氮缺乏下添加额外碳源培养 | 第32页 |
| (二) 结果与分析 | 第32-38页 |
| ·、三酰甘油含量标准曲线 | 第32-33页 |
| ·、水溶蛋白,总糖含量标准曲线 | 第33-34页 |
| ·、Y-002的18S rDNA分析 | 第34页 |
| ·、营养元素的限制对Y-002生长和油脂积累的影响 | 第34-36页 |
| ·、高碳培养基HSM在氮、硫、磷的限制培养对细胞干重,蛋白质,糖含量的影响 | 第36-37页 |
| ·、高碳培养基SE-N增加碳含量对Y002培养的影响 | 第37-38页 |
| (三) 讨论 | 第38-39页 |
| 三、微藻产油策略二:人工诱变育种 | 第39-42页 |
| (一) 材料与方法 | 第39-40页 |
| ·、培养基 | 第39页 |
| ·、仪器 | 第39页 |
| ·、试剂 | 第39页 |
| ·、藻株筛选及培养条件 | 第39页 |
| ·、菌株与质粒 | 第39-40页 |
| ·、玻璃珠转化莱茵衣藻 | 第40页 |
| ·、转化子的筛选 | 第40页 |
| (二) 结果与分析 | 第40-42页 |
| ·、线性化质粒pSP124S | 第40-41页 |
| ·、突变株的生长和油脂积累 | 第41-42页 |
| (三) 讨论 | 第42页 |
| 四、微藻产油策略三(上):产油相关基因筛选--CrDGAT基因沉默 | 第42-56页 |
| (一) 材料与方法 | 第42-49页 |
| ·、培养基 | 第42-43页 |
| ·、仪器 | 第43页 |
| ·、藻株筛选及其生长条件 | 第43-44页 |
| ·、获取莱茵衣藻CC425的cDNA | 第44页 |
| ·、CrDGAT基因的克隆与RNA干扰载体的构建 | 第44-48页 |
| ·、CrDGAT基因的克隆 | 第44-45页 |
| ·、RNAi中间载体的构建 | 第45页 |
| ·、RNAi反向重复片段的克隆 | 第45-46页 |
| ·、RNAi反向重复结构的构建 | 第46-47页 |
| ·、Maa7/XIR载体去磷酸化 | 第47页 |
| ·、RNAi载体的构建 | 第47-48页 |
| ·、电击转化莱菌衣藻CC425 | 第48页 |
| ·、莱茵衣藻CC425转化子的筛选及检测 | 第48-49页 |
| (二)结果与分析 | 第49-56页 |
| ·、获取莱茵衣藻CC425的cDNA基因序列 | 第49页 |
| ·、获取CrDGAT的cDNA基因序列 | 第49页 |
| ·、RNAi反向重复片段 | 第49-50页 |
| ·、RNAi中间载体 | 第50-52页 |
| ·、RNAi反向重复结构的构建 | 第52页 |
| ·、siRNA表达载体的构建 | 第52-53页 |
| ·、莱茵衣藻CC425转化子的筛选 | 第53-54页 |
| ·、转化子中性脂含量的检测 | 第54-56页 |
| (三) 讨论 | 第56页 |
| 五、微藻产油策略三(下):CrDGAT过量表达与亚细胞定位 | 第56-65页 |
| (一) 材料与方法 | 第56-61页 |
| ·、材料与仪器 | 第56-58页 |
| ·、试剂 | 第56-57页 |
| ·、质粒 | 第57页 |
| ·、PCR引物 | 第57页 |
| ·、培养基 | 第57-58页 |
| ·、仪器 | 第58页 |
| ·、方法 | 第58-59页 |
| ·、过量表达与亚细胞定位基因片段PCR扩增 | 第58页 |
| ·、质粒DNA的酶切 | 第58-59页 |
| ·、质粒片段的连接 | 第59页 |
| ·、重组质粒的转化 | 第59页 |
| ·、菌株的培养 | 第59页 |
| ·、重组质粒的鉴定 | 第59页 |
| ·、酶切鉴定 | 第59页 |
| ·、重组质粒的测序 | 第59页 |
| ·、过量表达对藻株中性脂含量的影响 | 第59-60页 |
| ·、CrDGAT亚细胞定位 | 第60-61页 |
| ·、CrDGAT在藻株中的亚细胞定位 | 第60页 |
| ·、基因枪轰击洋葱表皮细胞 | 第60-61页 |
| ·、微弹制备 | 第60页 |
| ·、DNA的包裹 | 第60页 |
| ·、基因枪的操作步骤 | 第60-61页 |
| ·、绿色荧光蛋白的观测 | 第61页 |
| (二) 结果与分析 | 第61-65页 |
| ·、CrDGATs基因表达载体的构建 | 第61-64页 |
| ·、重组质粒的酶切鉴定 | 第61页 |
| ·、pGEX-6p-1和pCAMBIA1302载体及CrDGAT位点 | 第61-62页 |
| ·、pGEX-6p-1的过量表达 | 第62-64页 |
| ·、CrDGAT-1-pCAMBIA1302与CrDGAT-5-pCAMBIA1302的亚细胞定位 | 第64-65页 |
| ·、CrDGAT-1与CrDGAT-5在洋葱细胞的亚细胞定位 | 第64页 |
| ·、CrDGAT-1与CrDGAT-5在衣藻CC425中的细胞定位 | 第64-65页 |
| (三) 讨论 | 第65页 |
| 结论 | 第65-67页 |
| 参考文献 | 第67-73页 |
| 后记 | 第73页 |
