| 目录 | 第1-9页 |
| 缩略表 | 第9-11页 |
| 摘要 | 第11-13页 |
| ABSTRACT | 第13-15页 |
| 第一章 研究背景与立题依据 | 第15-23页 |
| ·研究背景 | 第15-22页 |
| ·海冰环境 | 第15页 |
| ·海冰细菌 | 第15-16页 |
| ·海冰细菌的生理生态学 | 第15-16页 |
| ·海冰细菌的生态作用 | 第16页 |
| ·蛋白酶概述 | 第16-17页 |
| ·Thermolysin家族 | 第17-20页 |
| ·底物特异性 | 第17页 |
| ·Thermolysin家族的蛋白酶的适冷进化机制 | 第17-18页 |
| ·Thermolysin家族的蛋白酶的成熟机制 | 第18-19页 |
| ·Pseudolysin和Vibriolysin | 第19-20页 |
| ·PPC(Pre-peptide C-terminal domain)结构域研究进展 | 第20-22页 |
| ·海洋细菌独特的营养富集方式 | 第20页 |
| ·PPC结构域的结构特征和生物学功能 | 第20-21页 |
| ·Vibriolysin家族蛋白酶C-端结构域与催化效率之间的关系 | 第21-22页 |
| ·立题依据 | 第22-23页 |
| 第二章 Pseudoalteromonas sp.SM495胞外金属蛋白酶E495的分离纯化和性质研究 | 第23-37页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第23-24页 |
| ·菌株 | 第23页 |
| ·培养基 | 第23页 |
| ·主要生化试剂、药品 | 第23-24页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第24页 |
| ·实验方法 | 第24-27页 |
| ·菌株的培养 | 第24-25页 |
| ·菌株的最适培养时间测定方法 | 第24-25页 |
| ·菌株的最适培养温度测定方法 | 第25页 |
| ·蛋白酶酶活测定方法 | 第25页 |
| ·蛋白质含量测定方法 | 第25页 |
| ·蛋白质电泳方法 | 第25-26页 |
| ·E495-M和E495-M-C1的纯化 | 第26-27页 |
| ·E495的N端蛋白序列的测定 | 第27页 |
| ·E495-M和E495-M-C1的稳定性分析 | 第27页 |
| ·结果与分析 | 第27-36页 |
| ·Pseudoalteromonas sp.SM495发酵条件的确定 | 第27-29页 |
| ·发酵时间对产酶的影响 | 第27-28页 |
| ·培养温度对产酶的影响 | 第28-29页 |
| ·Pseudoalteromonas sp.SM495所产蛋白酶的纯化及N端测序 | 第29-33页 |
| ·Pseudoalteromonas sp.SM495胞外金属蛋白酶的分离纯化 | 第29-31页 |
| ·蛋白酶N端序列的测定 | 第31-32页 |
| ·E495-M和E495-M-C1的分离纯化 | 第32-33页 |
| ·E495-M的基本酶学性质测定 | 第33-35页 |
| ·最适酶活温度 | 第33-34页 |
| ·最适pH | 第34-35页 |
| ·蛋白酶抑制剂对蛋白酶E495活性的影响 | 第35页 |
| ·E495-M和E495-M-C1的稳定性分析 | 第35-36页 |
| ·讨论 | 第36-37页 |
| 第三章 Thermolysin家族蛋白酶酶学特性的比较 | 第37-48页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第37-38页 |
| ·菌株与质粒 | 第37页 |
| ·培养基 | 第37页 |
| ·主要分子试剂和试剂盒 | 第37-38页 |
| ·主要生化试剂、药品 | 第38页 |
| ·主要仪器 | 第38页 |
| ·实验方法 | 第38-41页 |
| ·菌株的培养 | 第38-39页 |
| ·菌株与质粒的保存 | 第39页 |
| ·藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白的分离纯化 | 第39页 |
| ·E495、Pseudolysin和MCP-02的重组表达及分离纯化 | 第39页 |
| ·蛋白浓度测定 | 第39页 |
| ·以合成二肽为底物测定酶活 | 第39-40页 |
| ·以胶原蛋白和弹性蛋白为底物测定酶活 | 第40页 |
| ·胶原蛋白酶活测定 | 第40页 |
| ·弹性蛋白酶活测定 | 第40页 |
| ·以可溶性蛋白为底物测定酶活 | 第40-41页 |
| ·以酪蛋白蛋白为底物测定酶活 | 第40页 |
| ·以明胶为底物测定酶活 | 第40-41页 |
| ·以偶氮白蛋白为底物测定酶活 | 第41页 |
| ·以藻蓝蛋白为底物测定酶活 | 第41页 |
| ·以别藻蓝蛋白为底物测定酶活 | 第41页 |
| ·以γ-球蛋白为底物测定酶活 | 第41页 |
| ·结果与分析 | 第41-46页 |
| ·Pseudolysin、MCP-02、E495-M的底物特异性比较 | 第41-44页 |
| ·以合成二肽为底物的酶活比较分析 | 第41-42页 |
| ·以胶原蛋白和弹性蛋白为底物的酶活比较分析 | 第42页 |
| ·以可溶性蛋白为底物的酶活比较分析 | 第42-44页 |
| ·E495-M和E495-M-C1的底物催化效率比较 | 第44-46页 |
| ·以别藻蓝蛋白(APC)和藻蓝蛋白(CPC)为底物的酶活比较分析 | 第44-45页 |
| ·以FAGFA和α-casein为底物的酶活比较 | 第45-46页 |
| ·讨论 | 第46-48页 |
| ·E495-M,MCP-02和pseudolysin的催化效率 | 第46-47页 |
| ·E495-M and E495-M-C1活性—结构两者之间的关系 | 第47-48页 |
| 第四章 E495 C-端PPC(Pre-peptide C-terminal domain)结构域的重组表达、定点突变和功能研究 | 第48-67页 |
| ·实验材料、仪器和软件 | 第48-49页 |
| ·菌株与质粒 | 第48页 |
| ·培养基 | 第48页 |
| ·主要分子试剂和试剂盒 | 第48页 |
| ·主要生化试剂、药品 | 第48-49页 |
| ·主要仪器与耗材 | 第49页 |
| ·数据库及分析软件 | 第49页 |
| ·实验方法 | 第49-54页 |
| ·GST-融合PPC结构域的重组表达 | 第49-50页 |
| ·引物设计 | 第49页 |
| ·PCR反应体系及反应程序 | 第49-50页 |
| ·基因克隆中的其他操作 | 第50页 |
| ·PPC结构域定点突变及重组表达 | 第50-53页 |
| ·PPC结构域关键位点分析 | 第50-51页 |
| ·PPC结构域突变蛋白重组表达 | 第51-53页 |
| ·重组GST-PPC蛋白的分离纯化 | 第53页 |
| ·"pull-down"亲和层析 | 第53页 |
| ·等离子共振(SPR)动力学参数分析 | 第53-54页 |
| ·结果与分析 | 第54-63页 |
| ·PPC结构域基因序列的重组表达 | 第54-56页 |
| ·PPC结构域重组质粒的构建 | 第54-55页 |
| ·PPC结构域的重组表达 | 第55-56页 |
| ·PPC结构域关键位点的序列分析 | 第56-57页 |
| ·PPC结构域突变子的重组表达、分离纯化 | 第57-59页 |
| ·PPC结构域突变蛋白的构建 | 第57-58页 |
| ·PPC结构域突变蛋白的分离纯化 | 第58-59页 |
| ·重组GST-PPC1、PPC2、PPC12及其相应突变子对APC、CPC、Casein底物吸附特性的研究 | 第59-63页 |
| ·GST-PPC1、PPC2、PPC12的"pull-down"亲和层析 | 第59-60页 |
| ·GST-PPC1、PPC2、PPC12的等离子共振(SPR)动力学参数分析 | 第60-62页 |
| ·PPC结构域相应突变子的"pull-down"亲和层析 | 第62-63页 |
| ·PPC结构域相应突变子的SPR图谱分析 | 第63页 |
| ·讨论 | 第63-67页 |
| ·E495中PPC结构域关键性氨基酸残基 | 第63-64页 |
| ·PPC结构域底物吸附功能及其海冰环境适应机制探讨 | 第64-67页 |
| 全文总结与展望 | 第67-68页 |
| 参考文献 | 第68-74页 |
| 在读期间发表的论文 | 第74-75页 |
| 致谢 | 第75-76页 |
| 附录 | 第76-96页 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 | 第96页 |
