| 摘要 | 第1-4页 |
| Abstract | 第4-13页 |
| 1 引言 | 第13-33页 |
| ·肠出血型大肠杆菌0157：H7 | 第13-25页 |
| ·EHEC与EPEC致病性的比较 | 第13-14页 |
| ·肠出血型大肠杆菌 | 第14-18页 |
| ·Ⅲ型分泌系统 | 第18-25页 |
| ·蛋白质复合物的研究 | 第25-32页 |
| ·研究蛋白质复合物的意义 | 第25页 |
| ·蛋白质相互作用的经典研究方法 | 第25-28页 |
| ·串联亲和纯化 | 第28-30页 |
| ·蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Blue Native PAGE,BN PAGE) | 第30页 |
| ·质谱技术 | 第30-32页 |
| ·本课题的研究目的与意义 | 第32-33页 |
| 2 串联亲和纯化原核表达载体的构建及表达鉴定 | 第33-53页 |
| ·实验材料 | 第33-37页 |
| ·菌株和质粒 | 第33页 |
| ·试剂与耗材 | 第33页 |
| ·主要仪器 | 第33-34页 |
| ·主要溶液的配制 | 第34-37页 |
| ·实验方法 | 第37-45页 |
| ·pCTAP与pNTAP串联亲和纯化表达载体的设计策略 | 第37-38页 |
| ·pCTAP与pNTAP串联亲和纯化原核表达载体的构建 | 第38-42页 |
| ·pNTAP与pCTAP表达载体标签蛋白在-coli BL21(DE3)中的表达. | 第42-44页 |
| ·pNTAP与pCTAP在E.coli 0157：H7 EDL933感受态细胞中的表达 | 第44-45页 |
| ·实验结果 | 第45-50页 |
| ·pCTAP与pNTAP合成序列的密码子优化 | 第45页 |
| ·拼接模板全长的PCA结果与PCR扩增结果 | 第45-46页 |
| ·载体pUC18质粒双酶切及阳性转化子PCR鉴定 | 第46-47页 |
| ·基因序列测定结果 | 第47页 |
| ·pCTAP与pNTAP载体在大肠杆菌BL21(DE3)细菌中的表达鉴定 | 第47-49页 |
| ·pCTAP与pNTAP载体在大肠杆菌0157：H7菌株中的表达鉴定 | 第49-50页 |
| ·讨论 | 第50-53页 |
| ·串联亲和纯化表达载体的设计 | 第50-51页 |
| ·串联亲和纯化表达载体pNTAP与pCTAP的构建 | 第51页 |
| ·串联亲和纯化表达载体pNTAP与pCTAP的表达鉴定 | 第51-53页 |
| 3 利用串联亲和纯化技术分离大肠杆菌0157：H7伴侣蛋白GroEL复合物 | 第53-72页 |
| ·实验材料 | 第53-56页 |
| ·菌株和质粒 | 第53页 |
| ·试剂与耗材 | 第53页 |
| ·主要仪器 | 第53页 |
| ·主要溶液的配制 | 第53-56页 |
| ·实验方法 | 第56-62页 |
| ·构建重组表达载体pGroEL-TAP | 第56-58页 |
| ·GroEL-TAP串联亲和纯化 | 第58-60页 |
| ·SDS-PAGE分离蛋白复合物组分 | 第60-61页 |
| ·BN-PAGE分离蛋白复合物组分 | 第61页 |
| ·胶内酶切和质谱鉴定 | 第61-62页 |
| ·实验结果 | 第62-68页 |
| ·构建pGroEL-TAP表达载体 | 第62-63页 |
| ·pGroEL-TAP载体在大肠杆菌0157：H7菌中的表达鉴定 | 第63-64页 |
| ·串联亲和纯化条件的优化 | 第64-66页 |
| ·伴侣素GroEL蛋白的串联亲和纯化 | 第66-68页 |
| ·讨论 | 第68-72页 |
| ·pGroEL-TAP表达载体的构建及在0157：H7菌株中表达形式的鉴定. | 第69页 |
| ·串联亲和纯化条件的优化 | 第69-70页 |
| ·GroEL-TAP利用串联亲和纯化技术捕获蛋白复合物 | 第70-72页 |
| 4 利用串联亲和纯化方法寻找分子伴侣CesT和CesD在0157：H7中相互作用复合物 | 第72-84页 |
| ·实验材料 | 第72页 |
| ·菌株和质粒 | 第72页 |
| ·试剂与仪器 | 第72页 |
| ·实验方法 | 第72-75页 |
| ·构建重组表达载体pCesT-TAP和pCesD-TAP | 第72-74页 |
| ·融合蛋白CesT-TAP的串联亲和纯化 | 第74页 |
| ·融合蛋白CesD-TAP的串联亲和纯化 | 第74-75页 |
| ·SDS-PAGE和BN-PAGE分离蛋白复合物组分 | 第75页 |
| ·胶内酶切和质谱鉴定 | 第75页 |
| ·实验结果 | 第75-82页 |
| ·构建pCesT-TAP和pCesD-TAP表达载体 | 第75-76页 |
| ·pCesT-TAP和pCesD-TAP载体在大肠杆菌0157：H7菌中的表达鉴定 | 第76-77页 |
| ·融合蛋白CesT-TAP的串联亲和纯化 | 第77-80页 |
| ·融合蛋白CesD-TAP的串联亲和纯化 | 第80-82页 |
| ·讨论 | 第82-84页 |
| ·分子伴侣CesT的蛋白复合物的捕获 | 第82-83页 |
| ·分子伴侣CesD的蛋白复合物的捕获 | 第83-84页 |
| 5 分子伴侣CesT和CesD蛋白复合物功能的初步探究 | 第84-100页 |
| ·实验材料 | 第84页 |
| ·主要质粒 | 第84页 |
| ·主要试剂与仪器 | 第84页 |
| ·溶液配制 | 第84页 |
| ·蛋白质相互作用网络的构建 | 第84页 |
| ·实验方法 | 第84-87页 |
| ·蛋白质相互作用网络的构建 | 第84页 |
| ·融合蛋白CesT-GST、Hi s-EF-Tu和Hi s-GK的表达 | 第84-85页 |
| ·GST-pull down验证CesT与捕获蛋白His-EF-Tu、His-GK之间的相互作用 | 第85-87页 |
| ·实验结果 | 第87-94页 |
| ·CesT捕获蛋白质组分之间相互作用网络构建 | 第87-90页 |
| ·利用GST pul-down证实CesT与捕获蛋白延伸因子、甘油激酶之间存在相互作用关系 | 第90-92页 |
| ·CesD蛋白质相互作用网络构建 | 第92-94页 |
| ·讨论 | 第94-100页 |
| ·String数据库分析CesT捕获29种蛋白质之间相互作用网络 | 第94页 |
| ·String数据库分析CesD捕获15个蛋白质之间相互作用网络 | 第94-95页 |
| ·CesT捕获29种蛋白的功能分类 | 第95-100页 |
| 6 讨论 | 第100-103页 |
| 7 结论 | 第103页 |
| 8 展望 | 第103页 |
| 9 本课题主要创新之处 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
| 参考文献 | 第105-114页 |
| 作者简介 | 第114页 |
