| 摘要 | 第1-6页 |
| ABSTRACT | 第6-13页 |
| 第1章 绪论 | 第13-57页 |
| 1 海洋微生物 | 第13-26页 |
| ·引言 | 第13页 |
| ·微生物多样性及其研究方案 | 第13-19页 |
| ·微生物的纯培养 | 第14页 |
| ·磷脂脂肪酸分析 | 第14-15页 |
| ·生理学的方法—Biolog微孔板法 | 第15页 |
| ·分子生物学方法 | 第15-19页 |
| ·海洋微生物多样性、不可培养性 | 第19-21页 |
| ·海洋微生物的特殊性 | 第21-22页 |
| ·研究开发海洋微生物的意义 | 第22-26页 |
| ·从海洋微生物开发工业用酶 | 第22-23页 |
| ·海洋生物活性物质 | 第23-24页 |
| ·新型功能基因 | 第24-25页 |
| ·新种属微生物的重要来源 | 第25页 |
| ·保护海洋生态环境 | 第25页 |
| ·其它 | 第25-26页 |
| 2 宏基因组学 | 第26-45页 |
| ·引言 | 第26页 |
| ·宏基因组文库的载体 | 第26-27页 |
| ·宏基因组文库的宿主 | 第27-28页 |
| ·宏基因组文库的筛选 | 第28-35页 |
| ·序列的筛选方法 | 第28-31页 |
| ·功能筛选方法 | 第31-34页 |
| ·底物诱导基因表达法 | 第34-35页 |
| ·宏基因组文库的应用 | 第35-45页 |
| ·新功能基因的发现 | 第36-38页 |
| ·开发新型生物活性物质 | 第38页 |
| ·环境微生物群落结构分析 | 第38-40页 |
| ·微生物的多样性 | 第40-42页 |
| ·对人类健康的贡献 | 第42-43页 |
| ·开发重要的工业用酶 | 第43-45页 |
| 3 酯酶概述 | 第45-53页 |
| ·引言 | 第45页 |
| ·酯酶/脂肪酶分类 | 第45-46页 |
| ·酯酶的应用 | 第46-48页 |
| ·食品加工 | 第46-47页 |
| ·农业 | 第47页 |
| ·制药工业 | 第47页 |
| ·制浆造纸、纺织品、皮革处理以及烘焙工业 | 第47-48页 |
| ·洗涤添加剂方面 | 第48页 |
| ·酯酶/脂肪酶的三级结构 | 第48-50页 |
| ·酯酶催化机理 | 第50-51页 |
| ·酯酶的定向进化 | 第51-53页 |
| 4 立题依据和意义 | 第53-57页 |
| ·本课题的研究意义 | 第53-56页 |
| ·本课题研究的技术路线 | 第56-57页 |
| 第二章 实验材料与方法 | 第57-69页 |
| 1 实验材料 | 第57-59页 |
| ·菌株和质粒 | 第57页 |
| ·酶及生化试剂 | 第57页 |
| ·耗材类 | 第57页 |
| ·主要仪器设备 | 第57-58页 |
| ·母液及培养基的配制 | 第58-59页 |
| ·LB培养基 | 第58页 |
| ·SOC培养基 | 第58页 |
| ·BAC文库保存培养基 | 第58-59页 |
| ·10%PEG8000 | 第59页 |
| 2 实验方法 | 第59-69页 |
| ·宏基因组构建 | 第59-64页 |
| ·BAC质粒抽提 | 第59-60页 |
| ·脉冲场凝胶电泳分离基因组DNA | 第60页 |
| ·制备大肠杆菌电击感受态细胞 | 第60页 |
| ·透析袋的处理 | 第60-61页 |
| ·南海海表采样收集微生物菌体 | 第61页 |
| ·HMW基因组DNA制备 | 第61页 |
| ·电洗脱回收基因组DNA | 第61-62页 |
| ·基因组DNA的浓缩 | 第62页 |
| ·HMW基因组DNA的部分酶切与大量制备 | 第62页 |
| ·HMW基因组DNA的连接转化 | 第62-63页 |
| ·BAC文库质粒RFLP鉴定 | 第63页 |
| ·BAC文库质粒插入片段大小分析 | 第63-64页 |
| ·宏基因组文库的挑取与保存 | 第64页 |
| ·酯酶活性筛选、异源表达及酯酶活性测定 | 第64-69页 |
| ·BAC文库酯酶活性克隆筛选 | 第64页 |
| ·BAC质粒亚克隆 | 第64-65页 |
| ·EstA酯酶异源表达质粒构建 | 第65页 |
| ·EstB酯酶异源表达质粒构建 | 第65-66页 |
| ·蛋白表达与纯化 | 第66页 |
| ·EstA酯酶比活力测定 | 第66页 |
| ·EstB酯酶比活力测定 | 第66-67页 |
| ·酯酶最适温度测定 | 第67页 |
| ·酯酶最适pH测定 | 第67页 |
| ·有机溶剂、金属离子、EDTA、NaCl对酯酶活性的影响 | 第67页 |
| ·氨基酸残基定点突变 | 第67-68页 |
| ·引物序列 | 第68-69页 |
| 第三章 宏基因组文库构建 | 第69-76页 |
| 1 实验结果与分析 | 第69-74页 |
| ·海洋微生物菌体收集 | 第69页 |
| ·海洋微生物HMW基因组DNA制备 | 第69-70页 |
| ·海洋微生物HMW基因组的部分酶切 | 第70页 |
| ·制备大量制备部分酶切的HMW基因组DNA | 第70-72页 |
| ·HMW基因组DNA的连接转化 | 第72-74页 |
| 2 讨论 | 第74-76页 |
| 第四章 酯酶筛选与鉴定 | 第76-97页 |
| 1 宏基因组文库酯酶筛选 | 第76-77页 |
| ·海洋微生物宏基因组文库中酯酶和淀粉酶活性的高通量筛选 | 第76-77页 |
| ·具有酯酶活性质粒的亚克隆 | 第77页 |
| 2 酯酶基因序列比对、分子进化树分析 | 第77-84页 |
| ·酯酶编码基因的鉴定 | 第77-78页 |
| ·EstA和EstB同源基因分析 | 第78页 |
| ·EstA和EstB的分子进化树分析 | 第78-81页 |
| ·EstA和EstB氨基酸序列同源比对 | 第81-84页 |
| 3 酯酶的纯化与鉴定 | 第84-91页 |
| ·酯酶基因的过表达 | 第84-85页 |
| ·EstA和EstB的底物范围和比活力 | 第85-86页 |
| ·EstA和EstB活性位点氨基酸定点突变 | 第86页 |
| ·热稳定性,温度、pH对EstA和EstB活力的影响 | 第86-89页 |
| ·有机溶剂、阳离子、PMSF、NaCl对EstA和EstB活性的影响。 | 第89-91页 |
| 4 讨论 | 第91-97页 |
| 参考文献 | 第97-108页 |
| 附录 | 第108-109页 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果 | 第109-110页 |
| 致谢 | 第110页 |
