| 中文摘要 | 第1-9页 |
| 英文摘要 | 第9-11页 |
| 缩略词表 | 第11-12页 |
| 第一部分 文献综述 | 第12-39页 |
| 一、草酸的来源及其危害 | 第12-13页 |
| 二、草酸在生物体内的降解 | 第13-17页 |
| 1 草酸的氧化降解 | 第14-15页 |
| 2 草酸的脱羧降解 | 第15-17页 |
| 三、草酸脱羧酶 | 第17-33页 |
| 1 草酸脱羧酶的来源及理化性质 | 第17-25页 |
| ·来源 | 第17页 |
| ·主要理化性质 | 第17页 |
| ·OXDC酶活测定方法 | 第17-25页 |
| 2 草酸脱羧酶的一般结构特征——关于cupin超家族 | 第25-29页 |
| ·cupin超家族的家族成员 | 第25页 |
| ·OXDC的结构特征 | 第25-29页 |
| 3 真菌中的草酸脱羧酶 | 第29-31页 |
| 4 细菌中的草酸脱羧酶 | 第31-32页 |
| 5 草酸脱羧酶的应用 | 第32-33页 |
| ·在以抗菌核病为目的和以降低内源草酸为目的的植物基因工程育种中的应用 | 第32页 |
| ·在造纸工业和食品工业中的应用 | 第32页 |
| ·在临床诊断中的应用 | 第32-33页 |
| 四、关于Tat途径 | 第33-38页 |
| 五、本项研究的目的和意义 | 第38-39页 |
| 第二部分 材料与方法 | 第39-48页 |
| 一、材料 | 第39页 |
| 1 质粒与菌株 | 第39页 |
| 2 试剂 | 第39页 |
| 3 引物合成和测序 | 第39页 |
| 二、实验方法 | 第39-48页 |
| 1 农杆菌草酸脱羧酶基因(AtuOXDC)的克隆及序列分析 | 第39-41页 |
| ·农杆菌基因组DNA(total DNA)的提取 | 第39页 |
| ·农杆菌草酸脱羧酶基因(AtuOXDC)的PCR克隆 | 第39-41页 |
| ·农杆菌草酸脱羧酶基因(AtuOXDC)的序列分析 | 第41页 |
| ·AtuOXDC PCR产物序列准确性确认 | 第41页 |
| ·AtuOXDC N-端信号肽序列预测 | 第41页 |
| ·多重序列比对和系统树分析 | 第41页 |
| 2 农杆菌草酸脱羧酶基因的原核表达、表达产物纯化及酶活性测定 | 第41-43页 |
| ·截去信号肽序列的AtuTOXDC原核表达载体的构建 | 第41-42页 |
| ·AtuTOXDC在E.coli中的诱导表达与纯化 | 第42页 |
| ·AtuTOXDC原核表达产物的酶活性分析 | 第42页 |
| ·AtuOXDC抗血清的制备 | 第42-43页 |
| 3.农杆菌草酸脱羧酶的分泌特性验证 | 第43-48页 |
| ·含全长和截去信号肽序列的pTrFOXDC和pTrTOXDC农杆菌表达载体的构建 | 第43页 |
| ·pTrFOXDC载体构建 | 第43页 |
| ·pTrTOXDC载体构建 | 第43页 |
| ·全长和截去信号肽序列的AtuOXDC在E.coli中的表达 | 第43-44页 |
| ·AtuFOXDC和AtuTOXDC在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达及样品制备 | 第43-44页 |
| ·SDS-10%PAGE样品制备 | 第44页 |
| ·SDS-10%PAGE和western-blots检测 | 第44页 |
| ·含-RR-定点突变的农杆菌表达载体pTrMOXDC的构建 | 第44-45页 |
| ·AtuOXDC N-端信号肽-RR-基序的定点突变 | 第44-45页 |
| ·pTrMOXDC载体的构建 | 第45页 |
| ·AtuOXDC分泌特性验证 | 第45-48页 |
| ·pTrFOXDC、pTrTOXDC和pTrMOXDC质粒转化A.tumefaciens C58细胞 | 第45页 |
| ·AtuFOXDC、AtuTOXDC和AtuMOXDC基因在A.tumefaciens C58中的诱导表达 | 第45-47页 |
| ·农杆菌草酸脱羧酶的亚细胞定位 | 第47-48页 |
| 第三部分 结果 | 第48-64页 |
| 一、农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的克隆及序列分析 | 第48-56页 |
| 1.农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的克隆 | 第48-50页 |
| 2.AtuOXDC N-端信号肽序列预测 | 第50页 |
| 3.多序列比对和系统树分析 | 第50-55页 |
| 4.农杆菌草酸脱羧酶序列分析 | 第55-56页 |
| 二、农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的原核表达、表达产物纯化及酶活性测定 | 第56-58页 |
| 1.pET-AtuTOXDC原核表达载体的构建 | 第56页 |
| 2.AtuOXDC基因的原核表达 | 第56页 |
| 3.AtuOXDC基因原核表达产物NiNTA柱亲和层析纯化 | 第56-58页 |
| 4.AtuOXDC原核表达产物的酶活性测定 | 第58页 |
| 三、农杆菌草酸脱羧酶的分泌特性验证 | 第58-64页 |
| 1.pTrFOXDC和pTrTOXDC载体的构建 | 第58-59页 |
| 2 含-RR-定点突变的农杆菌表达载体pTrMOXDC的构建 | 第59-60页 |
| ·AtuOXDC N-端-RR-基序的定点突变 | 第59页 |
| ·pTrMOXDC载体的构建 | 第59-60页 |
| 3.AtuOXDC在大肠杆菌中的表达产物存在剪切信号 | 第60-61页 |
| 4.农杆菌草酸脱羧酶分布于细胞周质中 | 第61页 |
| 5.农杆菌草酸脱羧酶通过Tat途径分泌 | 第61-64页 |
| 第四部分 讨论 | 第64-69页 |
| 一、来自A.tumefaciens C58的草酸脱羧酶的克隆 | 第64页 |
| 二、农杆菌草酸脱羧酶的结构特征 | 第64-65页 |
| 三、农杆菌草酸脱羧酶的原核表达和活性检测 | 第65页 |
| 四、农杆菌草酸脱羧酶通过Tat途径转运 | 第65-69页 |
| 小结 | 第69-70页 |
| 参考文献 | 第70-79页 |
| 在学期间发表论文 | 第79页 |
| 在学期间获得成果及参与编写专著 | 第79-80页 |
| 在学期间主持或参与的课题 | 第80-81页 |
| 致谢 | 第81页 |
