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农杆菌草酸脱羧酶的原核表达与分泌特性验证

中文摘要第1-9页
英文摘要第9-11页
缩略词表第11-12页
第一部分 文献综述第12-39页
 一、草酸的来源及其危害第12-13页
 二、草酸在生物体内的降解第13-17页
  1 草酸的氧化降解第14-15页
  2 草酸的脱羧降解第15-17页
 三、草酸脱羧酶第17-33页
  1 草酸脱羧酶的来源及理化性质第17-25页
   ·来源第17页
   ·主要理化性质第17页
   ·OXDC酶活测定方法第17-25页
  2 草酸脱羧酶的一般结构特征——关于cupin超家族第25-29页
   ·cupin超家族的家族成员第25页
   ·OXDC的结构特征第25-29页
  3 真菌中的草酸脱羧酶第29-31页
  4 细菌中的草酸脱羧酶第31-32页
  5 草酸脱羧酶的应用第32-33页
   ·在以抗菌核病为目的和以降低内源草酸为目的的植物基因工程育种中的应用第32页
   ·在造纸工业和食品工业中的应用第32页
   ·在临床诊断中的应用第32-33页
 四、关于Tat途径第33-38页
 五、本项研究的目的和意义第38-39页
第二部分 材料与方法第39-48页
 一、材料第39页
  1 质粒与菌株第39页
  2 试剂第39页
  3 引物合成和测序第39页
 二、实验方法第39-48页
  1 农杆菌草酸脱羧酶基因(AtuOXDC)的克隆及序列分析第39-41页
   ·农杆菌基因组DNA(total DNA)的提取第39页
   ·农杆菌草酸脱羧酶基因(AtuOXDC)的PCR克隆第39-41页
   ·农杆菌草酸脱羧酶基因(AtuOXDC)的序列分析第41页
     ·AtuOXDC PCR产物序列准确性确认第41页
     ·AtuOXDC N-端信号肽序列预测第41页
     ·多重序列比对和系统树分析第41页
  2 农杆菌草酸脱羧酶基因的原核表达、表达产物纯化及酶活性测定第41-43页
   ·截去信号肽序列的AtuTOXDC原核表达载体的构建第41-42页
   ·AtuTOXDC在E.coli中的诱导表达与纯化第42页
   ·AtuTOXDC原核表达产物的酶活性分析第42页
   ·AtuOXDC抗血清的制备第42-43页
  3.农杆菌草酸脱羧酶的分泌特性验证第43-48页
   ·含全长和截去信号肽序列的pTrFOXDC和pTrTOXDC农杆菌表达载体的构建第43页
     ·pTrFOXDC载体构建第43页
     ·pTrTOXDC载体构建第43页
   ·全长和截去信号肽序列的AtuOXDC在E.coli中的表达第43-44页
     ·AtuFOXDC和AtuTOXDC在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达及样品制备第43-44页
     ·SDS-10%PAGE样品制备第44页
     ·SDS-10%PAGE和western-blots检测第44页
   ·含-RR-定点突变的农杆菌表达载体pTrMOXDC的构建第44-45页
     ·AtuOXDC N-端信号肽-RR-基序的定点突变第44-45页
     ·pTrMOXDC载体的构建第45页
   ·AtuOXDC分泌特性验证第45-48页
     ·pTrFOXDC、pTrTOXDC和pTrMOXDC质粒转化A.tumefaciens C58细胞第45页
     ·AtuFOXDC、AtuTOXDC和AtuMOXDC基因在A.tumefaciens C58中的诱导表达第45-47页
     ·农杆菌草酸脱羧酶的亚细胞定位第47-48页
第三部分 结果第48-64页
 一、农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的克隆及序列分析第48-56页
  1.农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的克隆第48-50页
  2.AtuOXDC N-端信号肽序列预测第50页
  3.多序列比对和系统树分析第50-55页
  4.农杆菌草酸脱羧酶序列分析第55-56页
 二、农杆菌草酸脱羧酶AtuOXDC基因的原核表达、表达产物纯化及酶活性测定第56-58页
  1.pET-AtuTOXDC原核表达载体的构建第56页
  2.AtuOXDC基因的原核表达第56页
  3.AtuOXDC基因原核表达产物NiNTA柱亲和层析纯化第56-58页
  4.AtuOXDC原核表达产物的酶活性测定第58页
 三、农杆菌草酸脱羧酶的分泌特性验证第58-64页
  1.pTrFOXDC和pTrTOXDC载体的构建第58-59页
  2 含-RR-定点突变的农杆菌表达载体pTrMOXDC的构建第59-60页
   ·AtuOXDC N-端-RR-基序的定点突变第59页
   ·pTrMOXDC载体的构建第59-60页
  3.AtuOXDC在大肠杆菌中的表达产物存在剪切信号第60-61页
  4.农杆菌草酸脱羧酶分布于细胞周质中第61页
  5.农杆菌草酸脱羧酶通过Tat途径分泌第61-64页
第四部分 讨论第64-69页
 一、来自A.tumefaciens C58的草酸脱羧酶的克隆第64页
 二、农杆菌草酸脱羧酶的结构特征第64-65页
 三、农杆菌草酸脱羧酶的原核表达和活性检测第65页
 四、农杆菌草酸脱羧酶通过Tat途径转运第65-69页
小结第69-70页
参考文献第70-79页
在学期间发表论文第79页
在学期间获得成果及参与编写专著第79-80页
在学期间主持或参与的课题第80-81页
致谢第81页

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