| 中文摘要 | 第1-13页 |
| 英文摘要 | 第13-17页 |
| 第一部分 文献综述 | 第17-48页 |
| 第一章 转基因动物乳腺生物反应器研究进展 | 第17-21页 |
| 1.国外转基因动物乳腺生物反应器研究进展 | 第18-19页 |
| 2.国内乳腺生物反应器研究开发进展 | 第19-21页 |
| 第二章 乳腺生物反应器的分子遗传学基础 | 第21-31页 |
| 1.真核生物的表达调控 | 第21-24页 |
| 2.乳蛋白基因的表达调控 | 第24-31页 |
| ·酪蛋白及其表达调控序列 | 第25-27页 |
| ·β-乳球蛋白(BLG) | 第27-29页 |
| ·乳清酸蛋白(WAP) | 第29-31页 |
| 第三章 乳腺特异性表达载体构建研究进展 | 第31-48页 |
| 1.启动子 | 第31-33页 |
| ·′和3′非翻译区 | 第33页 |
| ·'非转录区(5'UTR)中短阅读框架(uORF) | 第33-34页 |
| 4.增强子 | 第34页 |
| 5.基因座控制区与核基质黏附区及长片段调控序列的应用 | 第34-36页 |
| 6.转录后调控相关元件 | 第36-37页 |
| 7.翻译后修饰及功能基因选择 | 第37-38页 |
| 8.CMV启动/增强子 | 第38-39页 |
| 9.人乳铁蛋白的生物学功能 | 第39-40页 |
| 10.问题与展望 | 第40-42页 |
| 参考文献 | 第42-48页 |
| 第二部分 乳腺特异性表达hLF cDNA基因载体的构建 | 第48-100页 |
| 第一章 乳蛋白调控元件、人乳铁蛋白cDNA和相关启动/增强子的分离和扩增 | 第49-73页 |
| 1.材料和试剂 | 第49-50页 |
| ·仪器和器材 | 第49-50页 |
| ·主要试剂 | 第50页 |
| ·试验动物 | 第50页 |
| ·部分质粒和引物序列及合成 | 第50页 |
| 2.方法 | 第50-55页 |
| ·引物的处理 | 第50-51页 |
| ·PCR反应混合物组成 | 第51-52页 |
| ·PCR参数 | 第52页 |
| ·PCR产物的克隆 | 第52-54页 |
| ·PCR产物的纯化 | 第52-53页 |
| ·PCR产物浓缩 | 第53页 |
| ·浓缩的PCR产物与PGEM载体连接 | 第53页 |
| ·连接产物转化DH5a感受态细胞 | 第53-54页 |
| ·PCR产物克隆、转化、测序及同源性分析KSK | 第54页 |
| ·限制性内切酶消化反应 | 第54页 |
| ·单酶切反应 | 第54页 |
| ·双酶切反应 | 第54页 |
| ·DNA片段末端的补平 | 第54-55页 |
| ·DNA片段的分离与回收 | 第55页 |
| 3.乳腺特异性表达调控元件和hLFcDNA的分离 | 第55-73页 |
| ·牛as1-酪蛋白5'和3'端表达调控序列的分离和扩增 | 第55-60页 |
| ·哺乳动物基因组DNA的提取 | 第55-56页 |
| ·PCR扩增参数 | 第56-57页 |
| ·PCR纯化,浓缩处理见2.4 | 第57页 |
| ·PCR产物克隆 | 第57-60页 |
| ·山羊β-乳球蛋白5'和3'调控序列的扩增与克隆 | 第60-66页 |
| ·山羊β-乳球蛋白基因5'端和3'端调控区部分测序结果及同源性分析 | 第63-66页 |
| ·山羊β-酪蛋白调控序列的应用 | 第66页 |
| ·人乳铁蛋白cDNA的扩增和克隆 | 第66-71页 |
| ·Neo基因的扩增和克隆 | 第71页 |
| ·CMV启动/增强子的PCR扩增和克隆 | 第71-73页 |
| ·PCR反应体系 | 第71页 |
| ·PCR扩增参数(热启动法) | 第71-72页 |
| ·PCR产物定量和克隆 | 第72-73页 |
| 第二章 人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体构建 | 第73-100页 |
| 1.用山羊β-乳球蛋白调控元件构建乳腺特异性表达载体 | 第73-82页 |
| ·BnF95载体的构建和结构 | 第73-77页 |
| ·β-乳球蛋白3'端和Neo基因的连接: | 第73页 |
| ·β乳球蛋白3'调控区和Neo基因与β乳球蛋白5'端调控区的连接 | 第73-77页 |
| ·人乳铁蛋白基因和BN16的连接 | 第77页 |
| ·pBnCL14载体的构建和结构 | 第77-82页 |
| ·载体PCL的构建 | 第81页 |
| ·pBnCL14载体的构建 | 第81-82页 |
| ·pBnLC2G载体的构建和结构 | 第82页 |
| 2.牛as1-酪蛋白调控元件的乳腺特异性表达载体构建 | 第82-89页 |
| ·pbCN/LF载体的构建和结构 | 第82页 |
| ·pbCNCS/LF36载体的构建和结构 | 第82-89页 |
| ·PCL质粒消除Not Ⅰ位点 | 第89页 |
| 3.以山羊β-酪蛋白基因调控序列为启动子构建hLF表达载体 | 第89-93页 |
| ·pgCN/LF/g载体的构建和结构 | 第89页 |
| ·pgCNCG//LF25载体的构建和结构 | 第89-93页 |
| ·CMV插入到山羊β-酪蛋白调控序列5'端和3'端之间: | 第89-91页 |
| ·人乳铁蛋白基因同pBC1-Pcmv连接: | 第91-93页 |
| 4.讨论 | 第93-96页 |
| 参考文献 | 第96-100页 |
| 第三部分 外源基因转染乳腺上皮细胞及诱导表达 | 第100-123页 |
| 第一章 山羊乳腺上皮细胞培养 | 第100-106页 |
| 1.山羊乳腺上皮细胞分离和培养 | 第101-103页 |
| ·实验动物 | 第101页 |
| ·仪器、器械和器具 | 第101页 |
| ·主要试剂 | 第101页 |
| ·实验方法 | 第101-103页 |
| ·正常奶山羊的催乳 | 第101页 |
| ·山羊乳腺上皮细胞的分离和培养 | 第101-102页 |
| ·细胞冻存与解冻 | 第102-103页 |
| 2.结果分析 | 第103-106页 |
| ·奶山羊乳腺上皮细胞与成纤维细胞的分离纯化培养 | 第103页 |
| ·山羊乳腺上皮细胞生长观察 | 第103-106页 |
| ·乳腺上皮细胞的生长和形态 | 第103页 |
| ·山羊乳腺上皮细胞的贴壁与生长曲线 | 第103-104页 |
| ·细胞解冻后的存活率 | 第104-106页 |
| 第二章 外源基因电转染山羊乳腺上皮细胞及转基因细胞株筛选 | 第106-123页 |
| 1.仪器和试剂 | 第106-107页 |
| 2.方法 | 第107-110页 |
| ·乳腺特异性载体的准备 | 第107页 |
| ·细胞对G418的耐受性实验 | 第107页 |
| ·乳腺上皮细胞电转染外源基因 | 第107-108页 |
| ·电转染条件的优化 | 第107页 |
| ·BnF95、pBnCL14和pBnLC2G电转染奶山羊乳腺上皮细胞(GMECs) | 第107-108页 |
| ·G418抗性培养及转基因细胞株的筛选 | 第108-110页 |
| ·G418在培养液中的浓度确定 | 第108页 |
| ·阳性克隆细胞株的挑选 | 第108页 |
| ·PCR检测抗性细胞株外源基因整合 | 第108-109页 |
| ·整合外源基因的细胞的诱导表达 | 第109页 |
| ·诱导表达细胞株收集液ELISA检测 | 第109-110页 |
| 3.结果 | 第110-116页 |
| ·细胞转染的电参数 | 第110页 |
| ·转染细胞的筛选 | 第110-111页 |
| ·G418的特性 | 第110页 |
| ·G418筛选浓度的确定 | 第110页 |
| ·转染细胞抗性培养 | 第110-111页 |
| ·单克隆细胞的挑取 | 第111页 |
| ·转染细胞外源基因PCR检测结果 | 第111页 |
| ·获得的转基因细胞株 | 第111页 |
| ·转基因细胞表达结果 | 第111-116页 |
| 4.讨论 | 第116-119页 |
| ·细胞转染 | 第116-117页 |
| ·转染细胞的筛选 | 第117页 |
| ·抗性细胞株的PCR检测 | 第117页 |
| ·表达率和表达水平 | 第117-119页 |
| 参考文献 | 第119-123页 |
| 第四部分 乳腺特异性表达载体在小鼠中表达特性检验 | 第123-150页 |
| 第一章 转基因小鼠的产生 | 第123-133页 |
| 1.材料 | 第124页 |
| ·仪器 | 第124页 |
| ·试剂药品 | 第124页 |
| ·实验动物 | 第124页 |
| 2.方法 | 第124-127页 |
| ·显微注射DNA的准备 | 第124-125页 |
| ·DNA的准备 | 第124-125页 |
| ·小鼠超数排卵 | 第125页 |
| ·取卵 | 第125页 |
| ·原核显微注射 | 第125页 |
| ·输卵管胚胎移植 | 第125页 |
| ·转基因小鼠的整合检测 | 第125-127页 |
| ·鼠尾基因组DNA提取 | 第125-126页 |
| ·转基因小鼠PCR检测 | 第126-127页 |
| 3.结果 | 第127-133页 |
| ·小鼠出生和转基因小鼠的筛选 | 第127页 |
| ·转基因小鼠的传代 | 第127-133页 |
| 第二章 转基因小鼠乳表达特性分析 | 第133-150页 |
| 1.材料与试剂 | 第133页 |
| 2.方法 | 第133-136页 |
| ·PCR检测阳性转基因小鼠的乳汁表达检测 | 第133-134页 |
| ·乳汁收集及处理 | 第133页 |
| ·小鼠乳清的提取 | 第133-134页 |
| ·转基因小鼠乳清的酶联免疫(ELISA)检测 | 第134页 |
| ·抗原包被 | 第134页 |
| ·封闭 | 第134页 |
| ·靶蛋白与一抗作用 | 第134页 |
| ·加入酶标二抗 | 第134页 |
| ·显色 | 第134页 |
| ·结果判断 | 第134页 |
| ·转基因小鼠乳清的的蛋白印迹(Western Blot)检测 | 第134-136页 |
| ·转基因小鼠乳清的SDS-PAGE电泳 | 第134-135页 |
| ·转基因小鼠乳汁蛋白的Western Blot检测 | 第135-136页 |
| 3.结果 | 第136-140页 |
| ·转基因小鼠乳清的酶联免疫(ELISA)检测结果 | 第136-140页 |
| ·转基因小鼠乳清western blot和ELISA检测结果 | 第140页 |
| 4.讨论 | 第140-144页 |
| ·转基因小鼠出生率 | 第141页 |
| ·表达水平和表达率 | 第141页 |
| ·表达的定位性 | 第141-142页 |
| ·转基因小鼠传代与表达 | 第142-143页 |
| ·重组人乳铁蛋白的杂交电泳条带及分子量 | 第143-144页 |
| 参考文献 | 第144-150页 |
| 第五部分 分析讨论与结论 | 第150-156页 |
| 1.复合启动/增强子与基因表达调控网络 | 第150页 |
| 2.CMV启动/增强子的作用原理分析 | 第150-151页 |
| 3.复合启动/增强子hLF cDNA在乳腺上皮细胞中表达特性 | 第151-152页 |
| 4.人乳铁蛋白cDNA及基因组DNA与表达水平的关系 | 第152页 |
| 5.结论 | 第152-153页 |
| 参考文献 | 第153-156页 |
| 致谢 | 第156页 |
