| 摘要 | 第1-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 一 前言 | 第11-18页 |
| 1.骨形成蛋白受体-Ⅱ基因结构和功能的简介 | 第11-17页 |
| ·BMPR-Ⅱ基因结构及其作用机制 | 第11-13页 |
| ·BMPR-Ⅱ基因与原发式肺动脉高血压(PPH)的关系 | 第13-16页 |
| ·BMPR-Ⅱ基因在肿瘤细胞中的表达 | 第16页 |
| ·BMPR-Ⅱ基因与骨的形成与再生 | 第16-17页 |
| ·BMPR-Ⅱ基因与哺乳动物早期发育 | 第17页 |
| 2 国内外研究现状和课题意义 | 第17-18页 |
| 二 技术路线 | 第18-19页 |
| 三 实验仪器与材料 | 第19-23页 |
| 1 材料 | 第19-21页 |
| ·菌种、载体和细胞系 | 第19页 |
| ·主要试剂 | 第19-20页 |
| ·其它主要试剂的配方 | 第20-21页 |
| 2 主要仪器 | 第21-23页 |
| 四 实验方法 | 第23-36页 |
| 1 BMPR-Ⅱ基因5’侧翼序列片段的扩增 | 第23-24页 |
| ·片段2853bp和3586bp的PCR扩增 | 第23页 |
| ·引物设计 | 第23-24页 |
| 2 pGEM-3z-S_0重组质粒的构建 | 第24-29页 |
| ·片段2853bp及3586bp的TA克隆 | 第24-26页 |
| ·片段2853bp及3586bp连接反应条件 | 第24页 |
| ·转化细菌 | 第24-26页 |
| ·片段2853bp及3586bpTA克隆的鉴定 | 第26页 |
| ·pGEM-3z-2532定向克隆 | 第26-28页 |
| ·片段2853bpTA质粒双酶切 | 第26页 |
| ·电泳切胶回收 | 第26-27页 |
| ·载体pGEM3z双酶切 | 第27页 |
| ·载体pGEM-3z双酶切后清洁回收 | 第27-28页 |
| ·回收片段2532bp和载体pGEM3z连接 | 第28页 |
| ·转化细菌 | 第28页 |
| ·重组质粒双酶切及PCR鉴定 | 第28页 |
| ·pGEM-3z-S_0克隆 | 第28-29页 |
| ·重组质粒pGEM-3z-2532双酶切 | 第28页 |
| ·重组质粒pGEM-3z-2532双酶切后PCR清洁 | 第28页 |
| ·片段3586bpTA克隆质粒双酶切 | 第28-29页 |
| ·片段2925bp切胶回收 | 第29页 |
| ·pGEM-3z-2532双酶切PCR清洁回收产物和2925bp片段连接反应 | 第29页 |
| ·转化细菌 | 第29页 |
| ·重组质粒pGEM-3z-S_0鉴定 | 第29页 |
| 3 pGL3-Basic-S_0重组质粒的构建 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pGEM-3z-S_0双酶切 | 第29-30页 |
| ·重组质粒pGEM-3z-S_0双酶切产物切胶回收5457bp | 第30页 |
| ·荧光素酶报告载体pGL3-Basic双酶切 | 第30页 |
| ·荧光素酶报告载体pGL3-Basic双酶切产物PCR清洁回收 | 第30页 |
| ·连接反应 | 第30页 |
| ·转化细菌 | 第30页 |
| ·pGL3-Basic-S_0重组质粒鉴定 | 第30页 |
| 4 缺失片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7)重组质粒构建 | 第30-33页 |
| ·缺失片段PCR扩增 | 第30-32页 |
| ·引物设计 | 第30-31页 |
| ·PCR反应体系 | 第31页 |
| ·PCR反应条件 | 第31-32页 |
| ·PCR产物PCR清洁回收 | 第32页 |
| ·缺失片段PCR扩增PCR清洁回收产物双酶切反应 | 第32页 |
| ·荧光素酶报告载体pGL3-Basic双酶切 | 第32页 |
| ·荧光素酶报告载体pGL3-Basic双酶切PCR清洁回收 | 第32页 |
| ·目的片段与pGL3-Basic vector的连接 | 第32-33页 |
| ·转化细菌 | 第33页 |
| ·缺失片段(S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7)重组质粒的鉴定 | 第33页 |
| 5 细胞培养、转染及瞬时表达 | 第33-34页 |
| ·细胞培养 | 第33-34页 |
| ·细胞的传代 | 第33-34页 |
| ·细胞的复苏 | 第34页 |
| ·各缺失片段重组质粒细胞转染及瞬时表达 | 第34页 |
| 6 双荧光素酶试验 | 第34-36页 |
| ·HeLa、A549、SMMC-7721细胞裂解物的制备 | 第34-35页 |
| ·双荧光素酶活性测定 | 第35-36页 |
| 五 结果与分析 | 第36-52页 |
| 1 BMPR-Ⅱ基因5’侧翼序列片段的扩增 | 第36页 |
| 2 pGEM-3z-S_0重组质粒的构建 | 第36-39页 |
| ·片段2853bpTA和3586bpTA克隆 | 第38页 |
| ·定向克隆pGEM-3z-2532 | 第38-39页 |
| ·定向克隆pGEM-3z-S_0 | 第39页 |
| 3 重组质粒pGL3-Basic-S_0的构建 | 第39-41页 |
| ·pGL3-Basic Vetor的鉴定 | 第40页 |
| ·pGEM-3z-S_0重组质粒的构建 | 第40-41页 |
| 4 BMPR-Ⅱ基因5’侧翼缺失片段重组质粒的构建 | 第41-47页 |
| ·内参质粒pRL-TK Vector鉴定图 | 第42-43页 |
| ·各个缺失片段PCR扩增 | 第43页 |
| ·缺失片段(-5113bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S1 | 第43-44页 |
| ·缺失片段(-3791bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S2 | 第44页 |
| ·缺失片段(-2892bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S3 | 第44-45页 |
| ·缺失片段(-2348bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S4 | 第45页 |
| ·缺失片段(-1587bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S5 | 第45-46页 |
| ·缺失片段(-1251bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S6 | 第46页 |
| ·缺失片段(-931bp/-627bp)的重组质粒pGL3-Basic-S7 | 第46-47页 |
| 5 缺失片段重组质粒pGL3-Basic-S1、pGL3-Basic-S2、pGL3-Basic-S3、pGL3-Basic-S4、pGL3-Basic-S5、pGL3-Basic-S6、pGL3-Basic-S7荧光素酶活性的测定结果 | 第47-52页 |
| 六 讨论 | 第52-58页 |
| 1 pMD18-T Sinaple Vector | 第52页 |
| 2 pGEM-3z Vector | 第52-53页 |
| 3 基因表达调控的研究策略分析 | 第53-57页 |
| ·报告基因的表达及检测 | 第53-55页 |
| ·氯霉素乙酰转移酶 | 第54页 |
| ·β-半乳糖苷酶 | 第54页 |
| ·荧光素酶 | 第54-55页 |
| ·双荧光素酶报告基因测试系统 | 第55-57页 |
| 4 缺失重组子在Hela细胞、肺腺癌细胞A549、肝癌细胞SMMC7721中对荧光素酶表达的影响 | 第57-58页 |
| 七 小结 | 第58-59页 |
| 八 展望 | 第59-60页 |
| 九 参考文献 | 第60-63页 |
| 附录 | 第63-69页 |
| 致谢 | 第69页 |
