应用PCR法和LAMP法鉴定牛早期胚胎性别的研究
| 独创性声明 | 第1页 |
| 关于学位论文使用授权的说明 | 第2-7页 |
| 中文摘要 | 第7-8页 |
| Abstract | 第8-9页 |
| 第一部分 文献综述 | 第9-34页 |
| 第一章 性别决定机制与控制方法 | 第9-22页 |
| 1 性别决定的机制 | 第9-12页 |
| ·性别决定的生物学机制 | 第9-11页 |
| ·性别决定的发育学机制 | 第9-10页 |
| ·性别决定的遗传学机制 | 第10-11页 |
| ·性别决定的基因 | 第11-12页 |
| ·Y染色体基因-SRY | 第11页 |
| ·X染色体上与性别决定有关的基因 | 第11-12页 |
| ·常染色体上与性别决定有关的基因 | 第12页 |
| 2 性别控制方法 | 第12-22页 |
| ·受精前的性别控制 | 第12-15页 |
| ·X精子与Y精子的分离 | 第12-15页 |
| ·调节授精环境的pH值及输精时间 | 第15页 |
| ·受精后的性别鉴定 | 第15-22页 |
| ·早期胚胎的性别鉴定 | 第15-20页 |
| ·早期胎儿的性别鉴定 | 第20-22页 |
| 第二章 牛早期胚胎性别鉴定的方法 | 第22-34页 |
| 1 本研究的目的和意义 | 第22页 |
| 2 PCR技术 | 第22-28页 |
| ·PCR的原理 | 第22-23页 |
| ·PCR反应体系 | 第23-25页 |
| ·引物 | 第23-24页 |
| ·酶及其浓度 | 第24页 |
| ·dNTP的质量与浓度 | 第24页 |
| ·模板 | 第24-25页 |
| ·Mg~(2+)浓度 | 第25页 |
| ·PCR反应条件 | 第25-26页 |
| ·温度与时间的设置 | 第25-26页 |
| ·循环次数 | 第26页 |
| ·PCR反应特点 | 第26-27页 |
| ·特异性强 | 第26页 |
| ·灵敏度高 | 第26页 |
| ·简便、快速 | 第26页 |
| ·对样品的纯度要求低 | 第26-27页 |
| ·鉴定牛早期胚胎性别的PCR方法 | 第27-28页 |
| ·单重PCR(Simplex PCR) | 第27页 |
| ·多重PCR(Multiplex PCR) | 第27页 |
| ·两步PCR(Two-step PCR) | 第27-28页 |
| ·引物—扩展预扩增PCR(PEP—PCR) | 第28页 |
| ·巢式PCR(Nest PCR) | 第28页 |
| 3 LAMP技术 | 第28-34页 |
| ·LAMP的原理 | 第28-32页 |
| ·LAMP法专用引物的设计方法 | 第29页 |
| ·LAMP法扩增机制 | 第29-32页 |
| ·LAMP法的特点 | 第32-34页 |
| ·反应条件简单 | 第32页 |
| ·高特异性 | 第32页 |
| ·高效性(高度灵敏) | 第32-33页 |
| ·结果检测简单 | 第33-34页 |
| 第二部分 实验研究 | 第34-72页 |
| 实验一 PCR法鉴定牛早期胚胎性别的优化研究 | 第34-56页 |
| 一 材料与方法 | 第34-44页 |
| 1.实验材料 | 第34-37页 |
| ·实验样品 | 第34-35页 |
| ·主要仪器设备 | 第35页 |
| ·实验试剂 | 第35页 |
| ·主要试剂的配制 | 第35-37页 |
| 2.实验方法 | 第37-44页 |
| ·实验样品制备 | 第37-40页 |
| ·牛(羊、马、骆驼)组织DNA的制备 | 第37-38页 |
| ·牛血液基因组DNA的提取 | 第38-39页 |
| ·牛胚胎质量的评定和胚胎细胞的取样 | 第39-40页 |
| ·卵母细胞、牛精液、人头发毛囊的样品制备 | 第40页 |
| ·PCR反应体系的建立和优化 | 第40-44页 |
| 二 实验结果 | 第44-51页 |
| 1.反应体系优化的结果 | 第44-46页 |
| ·反应体系中各组成成分的优化结果 | 第44页 |
| ·退火温度的优化结果 | 第44页 |
| ·引物优化的结果 | 第44-45页 |
| ·重PCR反应体系的优化结果 | 第45页 |
| ·巢式PCR反应体系的优化结果 | 第45-46页 |
| 2.实验样品的鉴定结果 | 第46-51页 |
| ·牛组织DNA鉴定结果 | 第46-47页 |
| ·牛正常血液鉴定结果 | 第47-48页 |
| ·疑似异性双犊母牛血液的鉴定结果 | 第48页 |
| ·其他样品鉴定结果 | 第48-49页 |
| ·验证牛引物特异性样品的鉴定结果 | 第49页 |
| ·胚胎性别鉴定应用的结果 | 第49-51页 |
| 三 讨论与结论 | 第51-56页 |
| 1.模板的制备 | 第51页 |
| 2.引物的筛选 | 第51-52页 |
| 3.建立鉴定体系常见问题 | 第52-54页 |
| ·假阴性,不出现扩增条带 | 第52-53页 |
| ·假阳性 | 第53页 |
| ·出现非特异性扩增带 | 第53-54页 |
| ·出现片状拖带或涂抹带 | 第54页 |
| 4.现场应用出现的问题 | 第54页 |
| ·没有扩增结果 | 第54页 |
| ·鉴定与产犊结果不一致 | 第54页 |
| 5.PCR反应的污染问题 | 第54-55页 |
| 6.结论 | 第55-56页 |
| 实验二 LAMP牛胚胎性别鉴定试剂盒的应用研究 | 第56-72页 |
| 一 材料与方法 | 第56-60页 |
| 1.实验材料 | 第56-58页 |
| ·实验样品 | 第56-57页 |
| ·主要的仪器设备 | 第57页 |
| ·实验试剂 | 第57-58页 |
| 2.实验方法 | 第58-60页 |
| ·样品制备 | 第58页 |
| ·操作过程 | 第58-59页 |
| ·LAMP法结果的判定 | 第59-60页 |
| 二 实验结果 | 第60-68页 |
| 1.常规胚胎现场鉴定结果 | 第60-64页 |
| 2.性控胚胎鉴定结果 | 第64-66页 |
| 3.疑似异性双犊的母牛血样鉴定结果 | 第66页 |
| 4.LAMP与PCR法的对比研究结果 | 第66-68页 |
| 三 讨论与结论 | 第68-72页 |
| 1.LAMP法性别鉴定常出现的问题 | 第68-69页 |
| ·无扩增结果 | 第68页 |
| ·假阴性结果 | 第68页 |
| ·假阳性结果 | 第68-69页 |
| 2.性控胚胎鉴定的讨论 | 第69-70页 |
| 3.疑似异性双犊的母牛血样鉴定的讨论 | 第70页 |
| 4.LAMP与PCR法的分析比较讨论 | 第70-71页 |
| 5.结论 | 第71-72页 |
| 第三部分 结论 | 第72-73页 |
| 参考文献 | 第73-79页 |
| 致谢 | 第79-80页 |
| 作者简历 | 第80页 |
