| 一 前言 | 第1-20页 |
| 1 核酶的发现及其意义 | 第10-17页 |
| ·RNase P简介 | 第10-11页 |
| ·大肠杆菌来源RNase P的组成 | 第11-12页 |
| ·M1 RNA的高级结构特征 | 第12-13页 |
| ·M1 RNA与底物的作用模式 | 第13-14页 |
| ·金属阳离子对M1 RNA体外切割活性的影响 | 第14页 |
| ·EGS与M1GS | 第14-16页 |
| ·DNA-based EGS | 第16-17页 |
| 2 HCMV简介 | 第17-19页 |
| ·HCMV的命名 | 第17页 |
| ·HCMV的病毒学特征 | 第17页 |
| ·HCMV的感染特点 | 第17-18页 |
| ·HCMV的致病机制 | 第18页 |
| ·HCMV的危害 | 第18页 |
| ·DNA聚合酶UL54基因简介 | 第18-19页 |
| 3 课题意义 | 第19-20页 |
| 二 技术路线 | 第20-21页 |
| 三 材料和方法 | 第21-41页 |
| 1 主要仪器 | 第21页 |
| 2 实验材料 | 第21-24页 |
| ·质粒和菌种 | 第21-22页 |
| ·寡核苷酸片段 | 第22页 |
| ·主要试剂 | 第22页 |
| ·其它主要试剂的配方 | 第22-24页 |
| 3 实验方法 | 第24-41页 |
| ·底物UL54基因片段的选择及转录模板的获得 | 第24-25页 |
| ·底物UL54基因C片段克隆和D片段克隆的鉴定 | 第24页 |
| ·底物UL54基因C片段和D片段转录模板的线性化 | 第24-25页 |
| ·M1 RNA核酶转录模板的获得 | 第25-29页 |
| ·引物设计 | 第25页 |
| ·PCR扩增M1 RNA | 第25-26页 |
| ·pUC19质粒载体的制备 | 第26页 |
| ·对M1 RNAPCR产物和载体双酶切、连接 | 第26-27页 |
| ·制备感受态宿主菌 | 第27页 |
| ·转化大肠杆菌 | 第27页 |
| ·转化子的筛选、鉴定和测序 | 第27-28页 |
| ·pUC19-M1 RNA亚克隆质粒的制备 | 第28页 |
| ·M1 RNA核酶转录模板的线性化 | 第28页 |
| ·M1 RNA线性模板的末端平滑处理 | 第28-29页 |
| ·EGS的设计与体外转录模板的获得 | 第29-32页 |
| ·RNA-based EGS的获得 | 第29-32页 |
| ·RNA-based EGS的克隆 | 第29-31页 |
| ·EGS DNA的合成 | 第29-30页 |
| ·pUC19质粒载体的制备、双酶切和去磷酸化处理 | 第30页 |
| ·将含有T7启动子的EGS DNA片段与pUC19载体连接 | 第30页 |
| ·制备感受态宿主菌 | 第30页 |
| ·转化 | 第30页 |
| ·转化子的筛选、鉴定和测序 | 第30-31页 |
| ·pUC19-EGS克隆质粒的制备 | 第31页 |
| ·EGS转录模板的线性化 | 第31页 |
| ·EGS线性模板的末端平滑处理 | 第31-32页 |
| ·DNA-based EGS的设计与合成 | 第32页 |
| ·RNA Marker模板的制备 | 第32-33页 |
| ·确定RNA Marker的材料来源 | 第32-33页 |
| ·RNA Marker DNA模板的制备 | 第33页 |
| ·体外转录 | 第33-37页 |
| ·底物UL54基因小片段的体外转录 | 第33-35页 |
| ·UL54基因C片段和D片段预转录 | 第33-34页 |
| ·对UL54基因C片段和D片段进行同位素标记的体外转录 | 第34-35页 |
| ·M1 RNA核酶的体外转录 | 第35页 |
| ·EGS的体外转录 | 第35-36页 |
| ·RNA Marker的体外转录 | 第36页 |
| ·体外转录产物的检测 | 第36-37页 |
| ·EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割实验 | 第37-39页 |
| ·RNA-based EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割 | 第37-38页 |
| ·DNA-based EGS引导下M1 RNA对底物RNA片段的体外切割 | 第38页 |
| ·不同Mg~(2+)浓度下EGS引导M1 RNA对底物RNA片段体外切割的比较 | 第38-39页 |
| ·凝胶电泳与同位素扫描 | 第39-41页 |
| ·凝胶电泳 | 第39-40页 |
| ·凝胶的制备 | 第39页 |
| ·电泳条件 | 第39-40页 |
| ·电泳后处理 | 第40页 |
| ·压屏处理 | 第40页 |
| ·同位素扫描 | 第40-41页 |
| 四 结果与分析 | 第41-59页 |
| 1 克隆质粒PU54-C和PU54-D的构建与鉴定 | 第41-44页 |
| ·底物UL54基因小片段的克隆方案 | 第41-43页 |
| ·PU54-C质粒的双酶切鉴定 | 第43页 |
| ·PU54-D质粒的双酶切鉴定 | 第43-44页 |
| 2 M1 RNA亚克隆质粒pUC19-M1 RNA的鉴定 | 第44-45页 |
| ·载体的选择 | 第44-45页 |
| ·pUC19-M1 RNA克隆质粒的鉴定 | 第45页 |
| 3 pUC19-EGS克隆质粒的鉴定 | 第45-49页 |
| ·载体的选择 | 第45页 |
| ·EGS靶位的确定 | 第45-46页 |
| ·EGS的设计 | 第46-48页 |
| ·pUC19-EGS克隆质粒的鉴定 | 第48-49页 |
| 4 体外转录结果 | 第49-51页 |
| ·底物RNA体外转录产物的电泳检测结果 | 第49-50页 |
| ·M1 RNA核酶体外转录产物的电泳检测结果 | 第50页 |
| ·各RNA-based EGS体外转录产物的电泳检测结果 | 第50-51页 |
| 5 体外切割产物的电泳检测结果 | 第51-57页 |
| ·体外切割产物的理论预计 | 第51-52页 |
| ·体外切割产物电泳检测结果 | 第52-57页 |
| ·RNA-based EGS引导M1 RNA对底物的切割 | 第52-53页 |
| ·DNA-based EGS引导M1 RNA对底物的切割 | 第53-55页 |
| ·DNA-based EGS与RNA-based EGS引导M1 RNA对底物切割的比较 | 第55-56页 |
| ·不同Mg~(2+)浓度对M1 RNA切割效率的影响 | 第56-57页 |
| 6 EGS的体外筛选 | 第57-59页 |
| 五 讨论 | 第59-65页 |
| 1 EGS的设计 | 第59-60页 |
| 2 M1 RNA体外切割活性的影响因素 | 第60-65页 |
| ·底物片段 | 第60-63页 |
| ·底物、核酶与EGS的比例 | 第63页 |
| ·金属阳离子 | 第63-64页 |
| ·分子热运动 | 第64-65页 |
| 六 结论 | 第65-66页 |
| 七 附录 | 第66-72页 |
| 附录1 pUC19-M1 RNA重组质粒测序结果(序列+图谱) | 第66-67页 |
| 附录2 GENEBANK公布M1 RNA基因全序列 | 第67-68页 |
| 附录3 pUC19-T4EGS、pUC19-C6EGS、pUC19-T6EGS、pUC19-T7EGS重组质粒测序结果(序列+图谱) | 第68-72页 |
| 八 参考文献 | 第72-75页 |
| 九 致谢 | 第75页 |
