| 摘要 | 第1-8页 |
| Abstract | 第8-14页 |
| 第一章 引言 | 第14-41页 |
| 1. MicroRNA简介 | 第14-20页 |
| ·MicroRNA的概念与特征 | 第14页 |
| ·miRNA的发现 | 第14-15页 |
| ·miRNA的生物合成 | 第15-17页 |
| ·miRNA的作用机制和生物学功能 | 第17-19页 |
| ·miRNA与siRNA的异同 | 第19-20页 |
| 2. miRNA的研究方法概述 | 第20-27页 |
| ·miRNA检测技术 | 第20-22页 |
| ·Northern杂交 | 第20页 |
| ·Real-time PCR | 第20-21页 |
| ·microarray | 第21页 |
| ·核酸酶保护分析技术(RPA) | 第21页 |
| ·原位杂交(in situ hybridistation) | 第21-22页 |
| ·miRNA功能分析 | 第22-27页 |
| ·靶基因的计算机预测 | 第22页 |
| ·靶基因的生物学实验寻找 | 第22-25页 |
| ·上调或下调miRNA的表达 | 第25-26页 |
| ·miRNA或靶基因的点突变 | 第26页 |
| ·靶基因的实验验证 | 第26-27页 |
| 3. miRNA与肿瘤发生、诊断及治疗 | 第27-31页 |
| ·miRNA与肿瘤发生 | 第27-29页 |
| ·miRNA与肿瘤发生发展相关 | 第27-28页 |
| ·miRNA作为原癌基因 | 第28页 |
| ·miRNA作为抑癌基因 | 第28-29页 |
| ·miRNA与致瘤病毒 | 第29页 |
| ·miRNA与肿瘤诊断 | 第29-30页 |
| ·miRNA与肿瘤治疗 | 第30-31页 |
| 4. microRNA在肿瘤中的细胞周期调控作用 | 第31-32页 |
| ·MicroRNA抑制p27的表达促发肿瘤的形成 | 第31页 |
| ·microRNA参与p53抑癌通路调控细胞周期 | 第31-32页 |
| ·通过其他靶基因调控肿瘤的细胞周期进程 | 第32页 |
| 5. miR-16家族与肿瘤相关性 | 第32-35页 |
| ·miR-16家族与白血病 | 第33-34页 |
| ·miR-16家族与垂体瘤 | 第34页 |
| ·miR-16家族与前列腺癌 | 第34页 |
| ·miR-16家族与其他肿瘤 | 第34-35页 |
| 6. cyclin E1研究进展简介 | 第35-39页 |
| ·细胞周期简介 | 第35页 |
| ·细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶 | 第35-36页 |
| ·细胞周期蛋白E 1(cyclin E1)的生物学特性 | 第36-37页 |
| ·Cyclin E1与CDK2及其抑制物(cyclin-dpendent kinase inhibitors,CKIs) | 第37-38页 |
| ·cyclin E1与乳腺癌 | 第38-39页 |
| ·cyclin E1与肺癌 | 第39页 |
| 7. 本课题研究内容与意义 | 第39-41页 |
| ·第一部分 运用miRACE系统性的鉴定miR-16-1的作用靶标 | 第39-40页 |
| ·第二部分 肿瘤细胞中miR-16-1对CCNE1表达调控的研究 | 第40-41页 |
| 第二章 材料与方法 | 第41-67页 |
| 1. 材料 | 第41-50页 |
| ·实验所用菌株、细胞系及质粒 | 第41页 |
| ·主要生化药品及来源 | 第41-42页 |
| ·分子克隆所用的溶液试剂 | 第42-43页 |
| ·细胞操作相关试剂 | 第43页 |
| ·酶类 | 第43-44页 |
| ·本研究所用引物以及RNA oligos | 第44-45页 |
| ·分析软件 | 第45页 |
| ·绘图软件 | 第45页 |
| ·仪器 | 第45-46页 |
| ·溶液的配置 | 第46-50页 |
| ·抗生素溶液 | 第46页 |
| ·DMEM细胞培养基 | 第46-47页 |
| ·细胞用PBS缓冲液 | 第47页 |
| ·western blot所需溶液配制 | 第47-49页 |
| ·免疫共沉淀所需溶液 | 第49-50页 |
| 2. 方法 | 第50-67页 |
| ·普通克隆的构建方法 | 第50页 |
| ·大肠杆菌化转感受态的制备与转化 | 第50-51页 |
| ·受体菌的培养 | 第50页 |
| ·化转感受态细胞的制备 | 第50-51页 |
| ·化转感受态细胞的DNA转化 | 第51页 |
| ·转染用超纯质粒的制备 | 第51-52页 |
| ·细胞传代培养 | 第52-53页 |
| ·细胞复苏与冻存 | 第52页 |
| ·细胞传代 | 第52-53页 |
| ·细胞转染 | 第53-55页 |
| ·梭华-SofastTM基因转染试剂转染操作 | 第53页 |
| ·Lipofectamine 2000转染试剂转染步骤 | 第53-54页 |
| ·Oligofectamine转染试剂转染步骤 | 第54-55页 |
| ·RT-PCR | 第55-57页 |
| ·RNA的提取 | 第55页 |
| ·基因组DNA的消解 | 第55-56页 |
| ·RNA的逆转录 | 第56页 |
| ·以合成的cDNA为模板进行PCR | 第56-57页 |
| ·荧光定量PCR | 第57页 |
| ·标准样品的制备 | 第57页 |
| ·样品及标准样品的扩增 | 第57页 |
| ·Western blot | 第57-62页 |
| ·蛋白样品的制备 | 第57-58页 |
| ·蛋白含量的测定 | 第58-59页 |
| ·SDS-PAGE电泳 | 第59-60页 |
| ·转膜 | 第60-61页 |
| ·免疫反应 | 第61页 |
| ·化学发光,显影,定影 | 第61-62页 |
| ·凝胶图像定量分析 | 第62页 |
| ·UV紫外交联 | 第62页 |
| ·免疫共沉淀 | 第62-63页 |
| ·蛋白酶K降解 | 第63-64页 |
| ·双色荧光的测定 | 第64-65页 |
| ·样品及试剂的制备 | 第64页 |
| ·荧光值的测定 | 第64-65页 |
| ·流式细胞仪对细胞周期的检测 | 第65-67页 |
| ·流式细胞术分析之前对细胞的处理 | 第65-66页 |
| ·流式细胞仪分析 | 第66-67页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第67-92页 |
| 1. 第一部分 运用miRACE系统性的鉴定miR-16-1的作用靶标 | 第67-82页 |
| ·miRACE实验方法的建立 | 第67-69页 |
| ·miRACE方法实验流程简介 | 第67-68页 |
| ·miR-16-1靶标的克隆 | 第68-69页 |
| ·miR-16-1靶标mtag的提取和初步分析 | 第69-72页 |
| ·miR-16-1靶基因的靶位点分析 | 第72-77页 |
| ·靶基因位点的分布 | 第72页 |
| ·miR-16-1与靶基因的配对类型 | 第72-75页 |
| ·miR-16-1各个靶位点的具体基因分析 | 第75-77页 |
| ·靶基因的GoTerm分析 | 第77-79页 |
| ·讨论及下一步工作展望 | 第79-82页 |
| 2. 第二部分 肿瘤细胞中miR-16-1对CCNE1表达调控的研究 | 第82-92页 |
| ·实验结果 | 第82-90页 |
| ·生物信息预测显示在CCNE1 3’UTR区含有miR-16-1的靶位点 | 第82-84页 |
| ·miR-16-1下调内源CCNE1的表达 | 第84-85页 |
| ·荧光素酶报告基因验证miR-16-1对靶基因3’UTR区的调控 | 第85-87页 |
| ·miR-16-1通过下调CCNE1的表达导致细胞周期停滞在G0/G1期 | 第87-90页 |
| ·讨论 | 第90-92页 |
| 参考文献 | 第92-103页 |
| 研究生期间发表的论文 | 第103-104页 |
| 致谢 | 第104-105页 |
