| 中文摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 缩略词 | 第7-14页 |
| 第一章 文献综述 | 第14-33页 |
| 1.1 血小板生成素及其模拟肽类药物 | 第14-17页 |
| 1.1.1 血小板生成素简介 | 第14-15页 |
| 1.1.2 第一代血小板生成素药物 | 第15页 |
| 1.1.3 第二代血小板生成素药物 | 第15-17页 |
| 1.2 HSA融合技术 | 第17-20页 |
| 1.2.1 HSA简介 | 第18-19页 |
| 1.2.2 HSA融合技术的基本原理 | 第19-20页 |
| 1.2.3 HSA融合方向对融合蛋白活性的影响 | 第20页 |
| 1.2.4 连接肽的选择 | 第20页 |
| 1.3 重组蛋白真核表达系统的研究进展 | 第20-22页 |
| 1.3.1 酵母表达系统 | 第20-21页 |
| 1.3.2 昆虫细胞表达系统 | 第21页 |
| 1.3.3 哺乳动物细胞表达系统 | 第21-22页 |
| 1.4 重组蛋白在哺乳动物细胞中的表达 | 第22-32页 |
| 1.4.1 重组蛋白的稳定表达 | 第22-24页 |
| 1.4.2 大规模瞬时表达系统 | 第24-32页 |
| 1.5 立题依据 | 第32-33页 |
| 第二章 抗TMP兔多克隆抗体的制备及dTMP-HSA融合蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立 | 第33-48页 |
| 2.1 前言 | 第33-34页 |
| 2.2 材料与仪器 | 第34-37页 |
| 2.2.1 实验动物及主要试剂 | 第34页 |
| 2.2.2 相关溶液配制 | 第34-37页 |
| 2.2.3 主要仪器、耗材 | 第37页 |
| 2.3 实验方法 | 第37-41页 |
| 2.3.1 兔多克隆抗体血清的制备 | 第37-38页 |
| 2.3.2 抗体血清的纯化及鉴定 | 第38-39页 |
| 2.3.3 兔多克隆抗体效价的测定 | 第39-40页 |
| 2.3.4 dTMP-HSA融合蛋白双抗体夹心ELISA检测方法的建立 | 第40-41页 |
| 2.4 实验结果与分析 | 第41-46页 |
| 2.4.1 抗体血清的纯化 | 第41-42页 |
| 2.4.2 纯化抗体的Western blot鉴定 | 第42页 |
| 2.4.3 抗TMP兔多克隆抗体效价的测定 | 第42-43页 |
| 2.4.4 棋盘滴定法确定双抗体夹心法ELISA最适抗体工作浓度 | 第43页 |
| 2.4.5 双抗体夹心ELISA线性检测范围的确定 | 第43-45页 |
| 2.4.6 精密度和最低检测限的确定 | 第45页 |
| 2.4.7 特异性考察 | 第45-46页 |
| 2.5 讨论 | 第46-48页 |
| 第三章 dTMP-HSA融合蛋白瞬时表达系统的建立与优化 | 第48-80页 |
| 3.1 前言 | 第48-49页 |
| 3.2 材料与仪器 | 第49-53页 |
| 3.3 实验方法 | 第53-62页 |
| 3.3.1 细胞转染用质粒的提取 | 第53-54页 |
| 3.3.2 悬浮细胞的转染 | 第54-55页 |
| 3.3.3 悬浮细胞转染条件的优化 | 第55-57页 |
| 3.3.4 表达载体的选择 | 第57-58页 |
| 3.3.5 低温和丙戊酸(VPA)对细胞生长状态、转染效率及瞬时表达量的影响 | 第58页 |
| 3.3.6 dTMP-HSA融合蛋白的纯化与鉴定 | 第58-59页 |
| 3.3.7 dTMP-HSA融合蛋白的生物活性检测 | 第59-61页 |
| 3.3.8 使用WAVE波浪生物反应器进行大规模瞬时转染 | 第61-62页 |
| 3.4 实验结果与分析 | 第62-77页 |
| 3.4.1 质粒大提 | 第62-63页 |
| 3.4.2 CHO-S悬浮细胞瞬时转染条件的优化 | 第63-66页 |
| 3.4.3 293-F悬浮细胞瞬时转染条件的优化 | 第66-67页 |
| 3.4.4 表达载体的选择 | 第67-69页 |
| 3.4.5 低温和丙戊酸对CHO-S和293-F细胞生长状态、转染效率及瞬时表达量的影响 | 第69-73页 |
| 3.4.6 dTMP-HSA的分离纯化 | 第73-74页 |
| 3.4.7 dTMP-HSA活性测定 | 第74-76页 |
| 3.4.8 大规模瞬时表达dTMP-HSA融合蛋白 | 第76-77页 |
| 3.5 讨论 | 第77-80页 |
| 第四章 融合方向对融合蛋白表达量、生物活性及药代动力学参数的影响 | 第80-91页 |
| 4.1 前言 | 第80页 |
| 4.2 材料与仪器 | 第80-81页 |
| 4.2.1 细胞与实验动物 | 第80页 |
| 4.2.2 质粒 | 第80页 |
| 4.2.3 主要试剂 | 第80-81页 |
| 4.2.4 主要仪器 | 第81页 |
| 4.3 实验方法 | 第81-83页 |
| 4.3.1 融合方向对融合蛋白表达量的影响 | 第81-82页 |
| 4.3.2 融合蛋白的纯化与鉴定 | 第82页 |
| 4.3.3 HSA-dTMP和dTMP-HSA融合蛋白的活性检测 | 第82-83页 |
| 4.3.4 融合方向对融合蛋白小鼠体内药代动力学参数的影响 | 第83页 |
| 4.4 实验结果与分析 | 第83-90页 |
| 4.4.1 HSA-dTMP和dTMP-HSA的瞬时表达 | 第83-85页 |
| 4.4.2 HSA-dTMP和dTMP-HSA的分离纯化和鉴定 | 第85-86页 |
| 4.4.3 HSA-dTMP和dTMP-HSA生物活性检测 | 第86-88页 |
| 4.4.4 HSA-dTMP和dTMP-HSA融合蛋白小鼠体内药代动力学研究 | 第88-90页 |
| 4.5 讨论 | 第90-91页 |
| 第五章 高效稳定表达HSA/dTMP融合蛋白的重组CHO细胞株的建立 | 第91-105页 |
| 5.1 前言 | 第91页 |
| 5.2 材料与仪器 | 第91-92页 |
| 5.2.1 细胞与实验动物 | 第91页 |
| 5.2.2 质粒 | 第91-92页 |
| 5.2.3 主要试剂 | 第92页 |
| 5.2.4 主要仪器、耗材 | 第92页 |
| 5.3 实验方法 | 第92-95页 |
| 5.3.1 质粒大量提取 | 第92-93页 |
| 5.3.2 细胞培养 | 第93页 |
| 5.3.3 细胞转染 | 第93页 |
| 5.3.4 稳定细胞株的筛选 | 第93-94页 |
| 5.3.5 有限稀释单克隆筛选 | 第94-95页 |
| 5.3.6 扩大培养 | 第95页 |
| 5.3.7 高表达重组细胞株的稳定性检测 | 第95页 |
| 5.4 实验结果与分析 | 第95-103页 |
| 5.4.1 质粒大提 | 第95-96页 |
| 5.4.2 稳定细胞的筛选 | 第96-98页 |
| 5.4.3 有限稀释 | 第98-99页 |
| 5.4.4 扩大培养 | 第99-102页 |
| 5.4.5 表达量稳定性试验 | 第102-103页 |
| 5.5 讨论 | 第103-105页 |
| 第六章 全文总结 | 第105-106页 |
| 参考文献 | 第106-113页 |
| 在研期间研究成果 | 第113-114页 |
| 致谢 | 第114页 |
