| 摘要 | 第2-3页 |
| Abstract | 第3-4页 |
| 引言 | 第9-10页 |
| 1 文献综述 | 第10-19页 |
| 1.1 L-丙氨酸 | 第10-12页 |
| 1.1.1 L-丙氨酸概述 | 第10页 |
| 1.1.2 L-丙氨酸的应用 | 第10-11页 |
| 1.1.3 L-丙氨酸的生产方式 | 第11-12页 |
| 1.2 丙氨酸脱氢酶的来源及分布 | 第12-14页 |
| 1.2.1 氨基酸脱氢酶 | 第12-13页 |
| 1.2.2 丙氨酸脱氢酶 | 第13页 |
| 1.2.3 丙氨酸脱氢酶的来源 | 第13-14页 |
| 1.3 丙氨酸脱氢酶的结构 | 第14-15页 |
| 1.3.1 空间结构 | 第14-15页 |
| 1.3.2 丙酮酸的结合位点 | 第15页 |
| 1.3.3 NAD~+的结合位点 | 第15页 |
| 1.4 丙氨酸脱氢酶的性质 | 第15-16页 |
| 1.4.1 底物结合特异性 | 第15-16页 |
| 1.4.2 稳定性 | 第16页 |
| 1.5 丙氨酸脱氢酶的催化机理 | 第16-18页 |
| 1.5.1 氧化脱氨反应 | 第16-17页 |
| 1.5.2 氨化反应 | 第17-18页 |
| 1.6 丙氨酸脱氢酶的研究现状及意义 | 第18页 |
| 1.7 本论文的研究思路和研究内容 | 第18-19页 |
| 2 丙氨酸脱氢酶基因克隆、原核表达及产物纯化 | 第19-38页 |
| 2.1 引言 | 第19页 |
| 2.2 实验材料 | 第19-23页 |
| 2.2.1 实验仪器 | 第19-20页 |
| 2.2.2 实验药品及试剂 | 第20-21页 |
| 2.2.3 实验菌株及载体 | 第21页 |
| 2.2.4 实验培养基及溶液 | 第21-23页 |
| 2.3 实验方法 | 第23-33页 |
| 2.3.1 ald基因的获得 | 第23-26页 |
| 2.3.2 pET-28a-ald重组质粒的构建 | 第26-29页 |
| 2.3.3 重组质粒的诱导表达 | 第29页 |
| 2.3.4 重组蛋白的分离纯化 | 第29页 |
| 2.3.5 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达 | 第29-30页 |
| 2.3.6 蛋白浓度测定方法 | 第30-31页 |
| 2.3.7 酶活力测定方法 | 第31-32页 |
| 2.3.8 酶动力学参数测定方法 | 第32-33页 |
| 2.4 实验结果 | 第33-37页 |
| 2.4.1 PCR扩增目的基因片段 | 第33-34页 |
| 2.4.2 重组质粒pET-28a-ald的构建 | 第34页 |
| 2.4.3 重组质粒pET-28a-ald的双酶切验证 | 第34-35页 |
| 2.4.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第35页 |
| 2.4.5 重组蛋白浓度、活力及动力学参数 | 第35-37页 |
| 2.5 讨论 | 第37页 |
| 2.6 小结 | 第37-38页 |
| 3 丙氨酸脱氢酶的理性设计及改造 | 第38-55页 |
| 3.1 引言 | 第38-39页 |
| 3.2 实验材料 | 第39-41页 |
| 3.2.1 实验仪器 | 第39页 |
| 3.2.2 实验试剂 | 第39-40页 |
| 3.2.3 实验菌株 | 第40页 |
| 3.2.4 实验培养基及溶液 | 第40-41页 |
| 3.3 实验方法 | 第41-51页 |
| 3.3.1 同源建模 | 第41-44页 |
| 3.3.2 分子对接 | 第44-45页 |
| 3.3.3 分子动力学模拟 | 第45-48页 |
| 3.3.4 突变体基因的获得 | 第48-49页 |
| 3.3.5 突变体的转化 | 第49-50页 |
| 3.3.6 y93f,n299q质粒的诱导表达 | 第50页 |
| 3.3.7 突变体蛋白的分离纯化 | 第50页 |
| 3.3.8 SDS-PAGE检测突变体蛋白的表达 | 第50页 |
| 3.3.9 蛋白浓度测定方法 | 第50页 |
| 3.3.10 酶活力测定方法 | 第50页 |
| 3.3.11 酶动力学参数测定方法 | 第50-51页 |
| 3.4 实验结果 | 第51-54页 |
| 3.4.1 突变体在大肠杆菌中的表达及纯化 | 第51-52页 |
| 3.4.2 突变体的蛋白浓度、活力及动力学参数 | 第52-54页 |
| 3.5 讨论 | 第54页 |
| 3.6 小结 | 第54-55页 |
| 4 乳酸菌发酵产L-丙氨酸 | 第55-71页 |
| 4.1 引言 | 第55-56页 |
| 4.2 实验材料 | 第56-58页 |
| 4.2.1 实验仪器 | 第56页 |
| 4.2.2 实验试剂 | 第56-57页 |
| 4.2.3 实验菌株及载体 | 第57页 |
| 4.2.4 实验培养基及溶液 | 第57-58页 |
| 4.3 实验方法 | 第58-63页 |
| 4.3.1 pNZ8148质粒及ald片段引物的设计与合成 | 第58页 |
| 4.3.2 PCR扩增 | 第58-59页 |
| 4.3.3 PCR产物的纯化 | 第59页 |
| 4.3.4 pNZ8148-ald,pNZ8148-y93f质粒构建 | 第59-60页 |
| 4.3.5 pNZ8148-ald,pNZ8148-y93f连接产物的转化 | 第60-61页 |
| 4.3.6 pNZ8148-ald,pNZ8148-y93f质粒的提取 | 第61-62页 |
| 4.3.7 pNZ8148-ald,pNZ8148-y93f质粒PCR验证 | 第62页 |
| 4.3.8 测序 | 第62-63页 |
| 4.3.9 L-丙氨酸发酵方法 | 第63页 |
| 4.3.10 L-丙氨酸产量的测定方法 | 第63页 |
| 4.4 实验结果 | 第63-69页 |
| 4.4.1 PCR扩增基因片段 | 第63-64页 |
| 4.4.2 pNZ8148-ald,pNZ8148-y93f质粒的构建 | 第64页 |
| 4.4.3 L.lactisΔldh中重组质粒的构建 | 第64-65页 |
| 4.4.4 pNZ8148-ald,pNZ8148-y93f质粒PCR验证 | 第65-66页 |
| 4.4.5 L.lactisΔldh中重组质粒的PCR验证 | 第66页 |
| 4.4.7 L-丙氨酸的产量 | 第66-69页 |
| 4.5 讨论 | 第69页 |
| 4.6 小结 | 第69-71页 |
| 结论与展望 | 第71-72页 |
| 参考文献 | 第72-76页 |
| 附录A 缩略语表及名称说明 | 第76-78页 |
| 附录B pET-28a(+)质粒图谱 | 第78-79页 |
| 附录C pNZ8148质粒图谱 | 第79-80页 |
| 附录D pET-28a-ald部分测序结果 | 第80-81页 |
| 附录E pET-28a-y93f部分测序结果 | 第81-82页 |
| 附录F pET-28a-n299q部分测序结果 | 第82-83页 |
| 附录G pNZ8148-ald部分测序结果 | 第83-84页 |
| 附录H pNZ8148-y93f部分测序结果 | 第84-85页 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-88页 |
