| 摘要 | 第10-11页 |
| ABSTRACT | 第11页 |
| 缩略词表(Abbreviation) | 第12-13页 |
| 1 前言 | 第13-24页 |
| 1.1 研究问题的由来 | 第13-14页 |
| 1.1.1 猪伪狂犬病的控制与监测 | 第13页 |
| 1.1.2 猪伪狂犬病毒清除计划 | 第13-14页 |
| 1.2 文献综述 | 第14-24页 |
| 1.2.1 猪伪狂犬病 | 第14-17页 |
| 1.2.1.1 PR病原学 | 第14-15页 |
| 1.2.1.2 猪伪狂犬病流行病学 | 第15页 |
| 1.2.1.3 PRV基因组及gE糖蛋白 | 第15-16页 |
| 1.2.1.4 PRV流行毒株 | 第16-17页 |
| 1.2.2 猪伪狂犬病检测方法 | 第17-19页 |
| 1.2.2.1 猪伪狂犬检测方法概述 | 第17页 |
| 1.2.2.2 乳胶凝集试验 | 第17-18页 |
| 1.2.2.3 酶联免疫吸附试验 | 第18页 |
| 1.2.2.4 免疫胶体金层析实验 | 第18-19页 |
| 1.2.3 免疫层析技术 | 第19-22页 |
| 1.2.3.1 基于膜的横向免疫层析 | 第19-20页 |
| 1.2.3.2 胶体金免疫层析 | 第20-21页 |
| 1.2.3.3 免疫胶体金技术 | 第21-22页 |
| 1.2.4 磁珠介绍 | 第22-23页 |
| 1.2.4.1 磁珠简介 | 第22页 |
| 1.2.4.2 免疫磁珠 | 第22-23页 |
| 1.2.5 研究目的和意义 | 第23-24页 |
| 2 伪狂犬病毒gE蛋白原核表达与纯化 | 第24-33页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-27页 |
| 2.1.1 毒株、菌株和质粒 | 第24-25页 |
| 2.1.3 主要试剂及耗材 | 第25-26页 |
| 2.1.4 主要仪器设备 | 第26-27页 |
| 2.2 实验方法 | 第27-29页 |
| 2.2.1 质粒鉴定和保存 | 第27页 |
| 2.2.2 预表达 | 第27页 |
| 2.2.3 大量表达 | 第27页 |
| 2.2.4 镍柱亲和层析纯化 | 第27-28页 |
| 2.2.5 蛋白浓度测定 | 第28页 |
| 2.2.6 Westernblot | 第28-29页 |
| 2.3 蛋白表达纯化 | 第29-33页 |
| 2.3.1 质粒鉴定和转化结果 | 第29页 |
| 2.3.2 预表达结果 | 第29-30页 |
| 2.3.3 大量表达和纯化结果 | 第30-31页 |
| 2.3.4 蛋白浓度测定 | 第31-32页 |
| 2.3.5 Westernblot结果 | 第32-33页 |
| 3 PRVgE蛋白抗体间接ELISA方法建立 | 第33-43页 |
| 3.1 实验材料 | 第33-34页 |
| 3.1.1 包被抗原及血清 | 第33页 |
| 3.1.2 主要试剂耗材 | 第33页 |
| 3.1.3 主要试剂配方 | 第33-34页 |
| 3.2 实验方法 | 第34-37页 |
| 3.2.1 免疫条件优化 | 第35-36页 |
| 3.2.1.1 最佳包被浓度与血清稀释倍数的确定 | 第35页 |
| 3.2.1.2 最佳酶标二抗浓度的确定 | 第35页 |
| 3.2.1.3 最佳包被缓冲液 | 第35页 |
| 3.2.1.4 封闭条件的优化 | 第35-36页 |
| 3.2.2 Cut-off值的判定 | 第36页 |
| 3.2.3 gE蛋白抗体间接ELISA特异性 | 第36页 |
| 3.2.4 gE蛋白抗体间接ELISA敏感性 | 第36页 |
| 3.2.5 gE蛋白抗体间接ELISA重复性及保存实验 | 第36页 |
| 3.2.6 重组gE蛋白抗体间接ELISA与商品化试剂盒比较 | 第36-37页 |
| 3.3 间接ELISA方法建立结果 | 第37-43页 |
| 3.3.1 免疫条件优化结果 | 第37-39页 |
| 3.3.1.1 方阵滴定结果 | 第37页 |
| 3.3.1.2 包被条件优化结果 | 第37-38页 |
| 3.3.1.3 二抗稀释度的优化 | 第38页 |
| 3.3.1.4 封闭条件的优化 | 第38-39页 |
| 3.3.2 Cut-off值判定结果 | 第39-40页 |
| 3.3.3 间接ELISA特异性实验结果 | 第40页 |
| 3.3.4 敏感性实验结果 | 第40页 |
| 3.3.5 重复性及保存实验结果 | 第40-41页 |
| 3.3.6 实际样品实验结果 | 第41-43页 |
| 4 免疫胶体金层析方法的建立 | 第43-52页 |
| 4.1 材料和仪器 | 第43页 |
| 4.1.1 实验材料 | 第43页 |
| 4.1.2 主要试剂 | 第43页 |
| 4.1.3 主要仪器耗材 | 第43页 |
| 4.2 实验方法 | 第43-47页 |
| 4.2.1 实验原理 | 第43-44页 |
| 4.2.2 胶体金垫的制备 | 第44-46页 |
| 4.2.2.1 胶体金颗粒的制备及表征 | 第44-45页 |
| 4.2.2.2 免疫胶体金标记条件的优化 | 第45页 |
| 4.2.2.3 免疫胶体金的标记及粗纯化 | 第45-46页 |
| 4.2.2.4 免疫胶体金垫的制备 | 第46页 |
| 4.2.3 样品垫及吸水垫的制备 | 第46页 |
| 4.2.4 NC膜的选择及划线 | 第46页 |
| 4.2.5 试纸条装配及免疫方法的初步建立 | 第46页 |
| 4.2.6 敏感性实验 | 第46页 |
| 4.2.7 特异性实验 | 第46-47页 |
| 4.3 胶体金免疫层析方法结果 | 第47-52页 |
| 4.3.1 胶体金合成结果 | 第47-48页 |
| 4.3.2 免疫胶体金条件确定 | 第48-49页 |
| 4.3.3 免疫胶体金制备结果 | 第49页 |
| 4.3.4 试纸条制备结果 | 第49-50页 |
| 4.3.5 敏感性实验结果 | 第50-51页 |
| 4.3.6 特异性实验结果 | 第51-52页 |
| 5 免疫磁性微粒检测方法的建立 | 第52-60页 |
| 5.1 实验材料及仪器设备 | 第52页 |
| 5.1.1 主要实验材料 | 第52页 |
| 5.1.2 主要试剂 | 第52页 |
| 5.1.3 仪器设备 | 第52页 |
| 5.2 实验原理 | 第52-53页 |
| 5.3 实验方法 | 第53-55页 |
| 5.3.1 免疫磁珠的制备 | 第53页 |
| 5.3.1.1 磁珠表面羧基活化 | 第53页 |
| 5.3.1.2 磁珠与gE抗原蛋白的共价偶联 | 第53页 |
| 5.3.1.3 免疫磁珠的封闭 | 第53页 |
| 5.3.2 免疫过程 | 第53页 |
| 5.3.3 磁珠检测PRVgE蛋白抗体的条件优化 | 第53-55页 |
| 5.3.3.1 磁珠用量优化 | 第53-54页 |
| 5.3.3.2 抗原蛋白量优化 | 第54页 |
| 5.3.3.3 二抗稀释度优化 | 第54页 |
| 5.3.3.4 血清孵育时间的优化 | 第54页 |
| 5.3.3.5 二抗孵育时间的优化 | 第54页 |
| 5.3.3.6 底物反应时间的优化 | 第54-55页 |
| 5.3.4 特异性实验 | 第55页 |
| 5.3.5 敏感性、线性和重复性实验 | 第55页 |
| 5.4 基于磁珠的快速检测方法实验结果 | 第55-60页 |
| 5.4.1 磁珠用量 | 第55-56页 |
| 5.4.2 偶联抗原量优化结果 | 第56页 |
| 5.4.3 二抗稀释度的优化 | 第56页 |
| 5.4.4 血清孵育时间优化 | 第56-57页 |
| 5.4.5 二抗孵育时间优化 | 第57页 |
| 5.4.6 底物反应时间 | 第57-58页 |
| 5.4.7 特异性、敏感性、重复性 | 第58-60页 |
| 6 总结与讨论 | 第60-61页 |
| 参考文献 | 第61-69页 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 | 第69-70页 |
| 致谢 | 第70页 |