| 摘要 | 第3-5页 |
| Abstract | 第5-6页 |
| 一、前言 | 第12-28页 |
| 1 研究背景 | 第12-26页 |
| 1.1 HBV病毒颗粒结构 | 第13-14页 |
| 1.2 HBV Pol的结构 | 第14-15页 |
| 1.3 HBV Pol参与HBV基因组复制 | 第15-17页 |
| 1.4 HBV Pol的研究进展 | 第17-19页 |
| 1.5 HnRNPK的简介 | 第19页 |
| 1.6 HnRNPK的PCBPs属性 | 第19-23页 |
| 1.7 HnRNPK的亚细胞定位 | 第23-24页 |
| 1.8 HnRNPK KI domain的特性 | 第24-25页 |
| 1.9 HnRNPK参与核酸加工的研究进展 | 第25-26页 |
| 2、课题意义 | 第26-27页 |
| 3、研究思路 | 第27-28页 |
| 二、实验仪器、实验材料及试剂配制 | 第28-32页 |
| 2.1 主要实验仪器 | 第28-29页 |
| 2.2 主要实验材料 | 第29-30页 |
| 2.3 试剂配制 | 第30-32页 |
| 2.3.1 培养基及试剂配制 | 第30-32页 |
| 三、实验方法 | 第32-55页 |
| 3.1 pGEX-4T1ΔKI重组质粒的构建 | 第32-40页 |
| 3.1.1 hnRNPK-5’端截短型基因PCR | 第32页 |
| 3.1.2 hnRNPK-3’端截短型基因PCR | 第32-33页 |
| 3.1.3 hnRNPK-5’端截短型基因及hnRNPK-3’端截短型基因PCR产物切胶回收 | 第33-34页 |
| 3.1.4 pGEX-4T-1 载体小量抽提 | 第34页 |
| 3.1.5 hnRNPK-5’端截短型基因双酶切 | 第34-35页 |
| 3.1.6 hnRNPK-3’端截短型基因双酶切 | 第35页 |
| 3.1.7 pGEX-4T-1 载体双酶切 | 第35页 |
| 3.1.8 酶切产物清洁 | 第35-36页 |
| 3.1.9 hnRNPK-5’端截短型和hnRNPK-3’端截短型基因酶切产物与pGEX-4T-1 载体酶切产物连接 | 第36页 |
| 3.1.10 连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第36-38页 |
| 3.1.11 菌落PCR筛选、鉴定pGEX-4T1ΔKI重组质粒 | 第38页 |
| 3.1.12 pGEX-4T1ΔKI重组质粒酶切鉴定 | 第38-40页 |
| 3.2 GST-pulldown实验检测Pol与KI之间的相互作用 | 第40-45页 |
| 3.2.1 pGEX-4T1ΔKI重组质粒转化Rosetta表达菌 | 第40页 |
| 3.2.2 含有pGEX-4T1ΔKI重组质粒的菌种保藏 | 第40页 |
| 3.2.3 IPTG诱导GST- KI融合蛋白表达 | 第40-41页 |
| 3.2.4 SDS-PAGE检测GST-ΔKI融合蛋白样品 | 第41-42页 |
| 3.2.5 真核蛋白Pol-flag的获得 | 第42-43页 |
| 3.2.6 GST-pulldown | 第43-44页 |
| 3.2.7 SDS-PAGE检测GST-bead纯化GST融合蛋白样品 | 第44页 |
| 3.2.8 Western-blot | 第44-45页 |
| 3.3 pcDNA3.1-ΔKI-HA重组质粒的构建 | 第45-48页 |
| 3.3.1 hnRNPK-5’端截短型基因PCR | 第45页 |
| 3.3.2 hnRNPK-3’端截短型基因PCR | 第45页 |
| 3.3.3 hnRNPK-5’端截短型基因及hnRNPK-3’端截短型基因PCR产物切胶回收 | 第45-46页 |
| 3.3.4 pcDNA3.1（+）载体小量抽提 | 第46页 |
| 3.3.5 hnRNPK-5’端截短型基因双酶切 | 第46页 |
| 3.3.6 hnRNPK-3’端截短型基因双酶切 | 第46页 |
| 3.3.7 pcDNA3.1（+）载体双酶切 | 第46页 |
| 3.3.8 酶切产物清洁 | 第46页 |
| 3.3.9 hnRNPK-5’端截短型和hnRNPK-3’端截短型基因酶切产物与pcDNA3.1（+）载体酶切产物连接 | 第46-47页 |
| 3.3.10 连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第47页 |
| 3.3.11 菌落PCR筛选、鉴定pcDNA3.1-ΔKI-HA重组质粒 | 第47页 |
| 3.3.12 pcDNA3.1-ΔKI-HA重组质粒酶切鉴定 | 第47-48页 |
| 3.4 Co-immuneprecipitation实验检测Pol与KI之间的相互作用 | 第48-49页 |
| 3.4.1 细胞培养和质粒共同转染 | 第48页 |
| 3.4.2 裂解细胞获取上清 | 第48页 |
| 3.4.3 Co-immuneprecipitation | 第48-49页 |
| 3.4.4 Western-blot | 第49页 |
| 3.5 pGEX-4T1HD重组质粒的构建 | 第49-51页 |
| 3.5.1 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因PCR | 第49页 |
| 3.5.2 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因PCR产物切胶回收 | 第49页 |
| 3.5.3 pGEX-4T-1 载体小量抽提 | 第49页 |
| 3.5.4 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因双酶切 | 第49-50页 |
| 3.5.5 pGEX-4T-1 载体双酶切 | 第50页 |
| 3.5.6 酶切产物清洁 | 第50页 |
| 3.5.7 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因酶切产物与pGEX-4T-1 载体酶切产物连接 | 第50页 |
| 3.5.8 连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第50页 |
| 3.5.9 菌落PCR筛选、鉴定pGEX-4T1HD重组质粒 | 第50-51页 |
| 3.5.10 pGEX-4T1HD重组质粒酶切鉴定 | 第51页 |
| 3.6 GST-pulldown实验检测Pol与HD之间的相互作用 | 第51-52页 |
| 3.6.1 pGEX-4T1ΔKI重组质粒转化Rosetta表达菌 | 第51页 |
| 3.6.2 IPTG诱导GST-HD融合蛋白表达 | 第51页 |
| 3.6.3 真核蛋白Pol-flag的获得 | 第51页 |
| 3.6.4 GST-pulldown | 第51-52页 |
| 3.7 pcDNA3.1-HD-HA重组质粒的构建 | 第52-53页 |
| 3.7.1 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因PCR | 第52页 |
| 3.7.2 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因PCR产物切胶回收 | 第52页 |
| 3.7.3 pcDNA3.1（+）载体小量抽提 | 第52页 |
| 3.7.4 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因双酶切 | 第52页 |
| 3.7.5 pcDNA3.1（+）载体双酶切 | 第52页 |
| 3.7.6 酶切产物清洁 | 第52页 |
| 3.7.7 hnRNPK蛋白KI单独结构域基因酶切产物与pcDNA3.1（+）载体酶切产物连接 | 第52-53页 |
| 3.7.8 连接产物转化大肠杆菌DH5α | 第53页 |
| 3.7.9 菌落PCR筛选、鉴定pGEX-4T1HD重组质粒 | 第53页 |
| 3.7.10 pGEX-4T1HD重组质粒酶切鉴定 | 第53页 |
| 3.8 Co-immuneprecipitation实验检测Pol与HD之间的相互作用 | 第53-55页 |
| 3.8.1 细胞培养和质粒共同转染 | 第53页 |
| 3.8.2 裂解细胞获取上清 | 第53页 |
| 3.8.3 Co-ip | 第53-54页 |
| 3.8.4 Western-blot | 第54-55页 |
| 四、结果与分析 | 第55-69页 |
| 4.1 GST-pulldown实验检测缺失KI结构域的hnRNPK与Pol的相互作用 | 第55-60页 |
| 4.1.1 pGEX-4T1ΔKI重组质粒的构建 | 第55-57页 |
| 4.1.2 GST-pulldown实验检测Pol与KI结构域缺失型hnRNPK之间的相互作用 | 第57-60页 |
| 4.2 Co-ip实验检测缺失KI结构域的hnRNPK与Pol的相互作用 | 第60-62页 |
| 4.2.1 pcDNA3.1-ΔKI-HA重组质粒的构建 | 第60-61页 |
| 4.2.2 Co-ip实验进一步检测Pol与KI结构域缺失型hnRNPK之间的相互作用 | 第61-62页 |
| 4.3 GST-pulldown实验检测单独的KI结构域与Pol的相互作用 | 第62-67页 |
| 4.3.1 pGEX-4T1HD重组质粒构建（即只含有KI单独结构域的质粒） | 第62-64页 |
| 4.3.2 GST-pulldown实验检测Pol与HD之间的相互作用 | 第64-67页 |
| 4.4 Co-ip实验检测单独的KI结构域与Pol的相互作用 | 第67-69页 |
| 4.4.1 pcDNA3.1-HD-HA重组质粒构建 | 第67-68页 |
| 4.4.2 Co-ip实验进一步检测Pol与HD之间的相互作用 | 第68-69页 |
| 五、讨论 | 第69-73页 |
| 结论与展望 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-78页 |
| 附录 | 第78-80页 |
| 致谢 | 第80-81页 |
