| 摘要 | 第3-6页 |
| Abstract | 第6-9页 |
| 前言 | 第14-23页 |
| 1.慢性粒细胞白血病概述 | 第14页 |
| 2.长链非编码RNA概述 | 第14-15页 |
| 3.长链非编码RNA的功能及作用机制 | 第15-17页 |
| 4.长链非编码RNA的研究方法 | 第17-18页 |
| 5.长链非编码RNAH19概述及其表达特点 | 第18-19页 |
| 6.RNA干扰技术 | 第19-20页 |
| 7.研究假说与研究思路 | 第20-21页 |
| 8.技术路线 | 第21页 |
| 9.研究意义及创新之处 | 第21-22页 |
| 10.实验内容 | 第22-23页 |
| 第一部分 ：H19在K562细胞及CML小鼠模型中的功能研究 | 第23-38页 |
| 实验材料与方法 | 第23-31页 |
| 1.主要试剂和实验材料 | 第23页 |
| 2.H19-SiRNA序列和H19慢病毒表达载体 | 第23-24页 |
| 2.1 H19SiRNA序列 | 第23-24页 |
| 2.2 H19慢病毒表达载体 | 第24页 |
| 3.细胞株 | 第24页 |
| 4.主要试剂配制 | 第24-26页 |
| 4.1 含10%血清的细胞培养基 | 第24页 |
| 4.2 pH7.2磷酸缓冲液(PBS) | 第24-25页 |
| 4.3 配制2.7%的甲基纤维素半固体培养基 | 第25-26页 |
| 5.主要仪器和材料 | 第26页 |
| 6.实验方法 | 第26-31页 |
| 6.1 细胞培养 | 第26页 |
| 6.2 H19-SiRNA有效序列的筛选 | 第26-29页 |
| 6.3 建立稳定表达H19的K562细胞株 | 第29页 |
| 6.4 Real-timePCR检测细胞内H19mRNA的相对表达水平 | 第29页 |
| 6.5 H19对K562细胞colony形成的影响 | 第29-30页 |
| 6.6 H19在CML小鼠模型中的功能研究 | 第30-31页 |
| 实验结果 | 第31-36页 |
| 1.H19对K562细胞进展的影响 | 第31-33页 |
| 1.1 H19表达量检测 | 第31页 |
| 1.2 H19-SiRNA有效序列的筛选 | 第31-32页 |
| 1.3 H19慢病毒载体转染K562细胞的效率检测 | 第32-33页 |
| 1.4 H19过表达对K562细胞colony形成的影响 | 第33页 |
| 2.过表达H19对CML模型鼠Balb/c裸鼠的影响 | 第33-34页 |
| 3.过表达H19对CML模型小鼠NOD/SCID的影响 | 第34-36页 |
| 讨论 | 第36-38页 |
| 第二部分 ：lncRNAH19靶蛋白和靶miRNA的鉴定研究 | 第38-64页 |
| 实验材料与方法 | 第38-56页 |
| 1.主要试剂和实验材料 | 第38-39页 |
| 2.带有T7启动子序列的H19基因的引物序列 | 第39-40页 |
| 2.1 带有T7启动子序列的H19基因的引物序列 | 第39-40页 |
| 3.细胞株 | 第40页 |
| 4.主要试剂配制 | 第40-43页 |
| 4.1 配制10×TAE电泳缓冲液 | 第40页 |
| 4.2 配制0.8%的琼脂糖胶 | 第40页 |
| 4.3 LB培养基配制 | 第40页 |
| 4.4 LB固体培养基配制 | 第40-41页 |
| 4.5 配制5M的氯化钠 | 第41页 |
| 4.6 10×TBS缓冲液配制(pH=7.6) | 第41页 |
| 4.7 配制1×TBST缓冲液 | 第41页 |
| 4.8 配制1×转膜缓冲液(pH=8.5) | 第41页 |
| 4.9 配制封闭液 | 第41页 |
| 4.10 配制抗体稀释液 | 第41页 |
| 4.11 5×SDS-PAGE电泳缓冲液 | 第41-42页 |
| 4.12 1.5 mol/LpH=8.8Tris-HCL缓冲液 | 第42页 |
| 4.13 30%丙烯酰胺 | 第42页 |
| 4.14 10%的分离胶 | 第42页 |
| 4.15 5%浓缩胶 | 第42-43页 |
| 5.主要仪器和材料 | 第43-44页 |
| 6.实验方法 | 第44-56页 |
| 6.1 获得体外转录的模板 | 第44-47页 |
| 6.2 获得脱硫生物素标记的lncRNAH | 第47-49页 |
| 6.3 标记完成的RNA进行RNA-ProtienPullDown实验 | 第49-52页 |
| 6.4 RNA-BindingProtein复合物的检测 | 第52页 |
| 6.5 标记好的长链非编码RNAH19与RNA的结合 | 第52-53页 |
| 6.6 RNA-RNA结合复合物进行小RNA测序 | 第53-54页 |
| 6.7 WesternBlot验证目的蛋白 | 第54-55页 |
| 6.8 .lncRNAH19靶miRNA验证 | 第55页 |
| 6.9 生物信息学软件 | 第55-56页 |
| 实验结果 | 第56-61页 |
| 1.以H19慢病毒载体为模板扩增带有T7启动子的体外转录的模板 | 第56页 |
| 2.体外转录产物lncRNAH19的鉴定 | 第56-57页 |
| 3.RNApull-down后RNA-bindingprotein的鉴定 | 第57页 |
| 4.RNApull-down产物的蛋白质谱鉴定 | 第57-58页 |
| 5.lncRNAH19pull-down的质谱检测和软件预测共同存在的蛋白质分子 | 第58-59页 |
| 6.WesternBlot验证长链非编码RNAH19的靶蛋白PCBP1和FUS | 第59页 |
| 7.RNA-seq检测长链非编码RNAH19的靶miRNA | 第59-60页 |
| 8.Real-timePCR验证lncRNAH19的靶miRNA | 第60-61页 |
| 讨论 | 第61-64页 |
| 第三部分 lncRNAH19靶蛋白和靶miRNA的功能研究 | 第64-78页 |
| 实验材料与方法 | 第64-70页 |
| 1.主要试剂和实验材料 | 第64-65页 |
| 2.miR-19a-3p和miR-106b-5p反义核酸的序列、PCBP1-siRNA和FUS-siRNA序列 | 第65页 |
| 2.1 miR-19a-3p和miR-106b-5p反义核酸的序列 | 第65页 |
| 2.2 PCPB1-SiRNA和FUS-SiRNA序列 | 第65页 |
| 3.细胞株 | 第65页 |
| 4.主要试剂配制 | 第65-66页 |
| 4.1 MTT溶液 | 第65-66页 |
| 5.主要仪器和材料 | 第66页 |
| 6.实验方法 | 第66-70页 |
| 6.1 PCBP1-SiRNA和FUS-SiRNA有效序列的筛选 | 第66-67页 |
| 6.2 靶向抑制PCBP1和FUS对K562细胞colony形成的影响 | 第67页 |
| 6.3 靶向抑制PCPB1和FUS对K562细胞Imatinib药物敏感性的作用 | 第67-68页 |
| 6.4 靶向抑制miR19a-3p和miR-106b-5p对K562细胞活力的影响 | 第68-69页 |
| 6.5 靶向抑制miR19a-3p和miR-106b-5p对K562细胞colony形成的影响 | 第69页 |
| 6.6 生物信息学软件 | 第69页 |
| 6.7 统计学处理 | 第69-70页 |
| 实验结果 | 第70-76页 |
| 1.PCPB1-SiRNA和FUS-SiRNA有效序列的筛选 | 第70-71页 |
| 2.PCPB1和FUS在K562细胞恶性进展的研究 | 第71-72页 |
| 2.1 靶向抑制PCPB1和FUS后对K562细胞恶性进展的影响 | 第71-72页 |
| 3.miR-19a-3p和miR-106b-5p在K562细胞恶性进展的研究 | 第72-74页 |
| 3.1 靶向抑制miR-19a-3p和miR-106b-5p后对K562细胞恶性进展的影响 | 第72-74页 |
| 4.信号通路分析整合 | 第74-76页 |
| 讨论 | 第76-78页 |
| 不足与展望 | 第78-79页 |
| 参考文献 | 第79-84页 |
| 附录英文缩略词 | 第84-85页 |
| 在读期间的科研成果 | 第85-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 附件1 | 第87-102页 |
| 附件2 | 第102-132页 |
