| 摘要 | 第3-5页 |
| abstract | 第5-6页 |
| 第1章 前言 | 第11-22页 |
| 1.1 肝癌 | 第11页 |
| 1.1.1 肝癌简介 | 第11页 |
| 1.1.2 肝癌的发病机制 | 第11页 |
| 1.1.3 肝癌治疗策略 | 第11页 |
| 1.2 Kallistatin简介 | 第11-14页 |
| 1.2.1 Kallistatin的来源 | 第12页 |
| 1.2.2 KAL的结构 | 第12页 |
| 1.2.3 KAL的功能 | 第12-13页 |
| 1.2.4 舒张血压 | 第13页 |
| 1.2.5 抗炎作用 | 第13页 |
| 1.2.6 抗氧化应激和纤维化 | 第13页 |
| 1.2.7 抗血管生成、抗肿瘤 | 第13-14页 |
| 1.2.8 KAL体外表达 | 第14页 |
| 1.3 中国仓鼠卵巢细胞表达系统简介 | 第14-18页 |
| 1.3.1 蛋白表达系统简介 | 第14-15页 |
| 1.3.2 CHO细胞表达优点 | 第15-16页 |
| 1.3.3 高效稳定的CHO表达系统策略 | 第16-18页 |
| 1.4 凋亡 | 第18-19页 |
| 1.5 本课题的来源、研究思路与主要研究内容 | 第19-22页 |
| 1.5.1 本课题来源与研究意义 | 第19页 |
| 1.5.2 本课题研究思路 | 第19页 |
| 1.5.3 主要研究内容 | 第19-22页 |
| 第2章 KALLISTATIN高表达载体的构建 | 第22-44页 |
| 2.1 实验材料 | 第22-25页 |
| 2.1.1 质粒载体与菌株 | 第22-23页 |
| 2.1.2 试剂耗材 | 第23页 |
| 2.1.3 设备仪器 | 第23-24页 |
| 2.1.4 溶液配置 | 第24-25页 |
| 2.2 实验方法 | 第25-35页 |
| 2.2.1 CKN与TKN载体构建 | 第27-30页 |
| 2.2.2 pcDNA3.1载体与不同片段的载体 | 第30-33页 |
| 2.2.3 In-Fusion构建pcDNA3.1-SP-Kal载体 | 第33-34页 |
| 2.2.4 pTT5-SP-Kal,pMH3-SP-Kal和pMH3EN-SP-Kal载体构建 | 第34-35页 |
| 2.3 实验结果 | 第35-42页 |
| 2.3.1 CKN与TKN载体构建 | 第35-36页 |
| 2.3.2 高表达载体构建鉴定 | 第36-37页 |
| 2.3.3 测序结果 | 第37-42页 |
| 2.4 讨论与小结 | 第42-44页 |
| 第3章 表达KAL的CHO稳定株筛选 | 第44-70页 |
| 3.1 实验材料 | 第44-49页 |
| 3.1.1 实验细胞 | 第44页 |
| 3.1.2 试剂耗材 | 第44-46页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第46-47页 |
| 3.1.4 溶液配制 | 第47-49页 |
| 3.2 实验方法 | 第49-59页 |
| 3.2.1 细胞培养 | 第49页 |
| 3.2.2 G418最佳筛选浓度确定 | 第49-50页 |
| 3.2.3 转染优化 | 第50-51页 |
| 3.2.4 瞬时转染确定最佳载体 | 第51-52页 |
| 3.2.5 双抗夹心法ELISA | 第52页 |
| 3.2.6 重组CHO稳定细胞株的筛选 | 第52-54页 |
| 3.2.7 蛋白水平检测 | 第54-55页 |
| 3.2.8 mRNA水平检测 | 第55-56页 |
| 3.2.9 CHO?KAL稳定株的悬浮无血清驯化 | 第56-57页 |
| 3.2.10 批量表达KAL | 第57页 |
| 3.2.11 Ni柱纯化蛋白 | 第57-58页 |
| 3.2.12 Westernblot检测 | 第58-59页 |
| 3.2.13 统计学处理 | 第59页 |
| 3.3 实验结果 | 第59-68页 |
| 3.3.1 G418筛选CHO-K1浓度 | 第59-60页 |
| 3.3.2 最佳转染条件与高效的载体 | 第60-62页 |
| 3.3.3 双抗夹心法ELISA检测条件 | 第62-63页 |
| 3.3.4 成功筛选出4株CHO?KAL细胞株 | 第63-64页 |
| 3.3.5 分次流加培养和压力培养可提高CHO表达量 | 第64-67页 |
| 3.3.6 CHO表达的KAL分子量为60kD | 第67-68页 |
| 3.4 讨论与小结 | 第68-70页 |
| 第4章 KALLISTATIN诱导肝癌细胞死亡 | 第70-78页 |
| 4.1 实验材料 | 第70-71页 |
| 4.1.1 实验细胞 | 第70页 |
| 4.1.2 实验试剂 | 第70-71页 |
| 4.1.3 仪器设备 | 第71页 |
| 4.1.4 溶液配制 | 第71页 |
| 4.2 实验方法 | 第71-73页 |
| 4.2.1 CCK-8检测KAL对肝癌细胞的影响 | 第71-72页 |
| 4.2.2 Hoechst33342染色 | 第72页 |
| 4.2.3 肝癌细胞Transwell实验 | 第72-73页 |
| 4.2.4 统计学处理 | 第73页 |
| 4.3 实验结果 | 第73-77页 |
| 4.3.1 KAL抑制肝癌细胞生长 | 第73-75页 |
| 4.3.2 KAL诱导肝癌细胞凋亡 | 第75页 |
| 4.3.3 KAL可抑制肝癌细胞迁移和侵袭 | 第75-77页 |
| 4.4 讨论与小结 | 第77-78页 |
| 第5章 结论与展望 | 第78-80页 |
| 5.1 研究结论 | 第78页 |
| 5.2 需要进一步开展的工作 | 第78-80页 |
| 参考文献 | 第80-86页 |
| 致谢 | 第86-87页 |
| 附录 | 第87-89页 |
| 个人简历、在校期间发表的学术论文及研究成果 | 第89页 |
