| 摘要 | 第5-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 1 前言 | 第17-28页 |
| 1.1 迟缓爱德华氏菌概述 | 第17-21页 |
| 1.1.1 分类地位及生物学特性 | 第17页 |
| 1.1.2 爱德华氏菌病 | 第17-18页 |
| 1.1.3 致病因子 | 第18-20页 |
| 1.1.3.1 如何适应多种宿主环境的机制 | 第18-19页 |
| 1.1.3.2 自身组分在细菌致病过程中发挥的作用 | 第19页 |
| 1.1.3.3 分泌组分在细菌致病过程中发挥的作用 | 第19-20页 |
| 1.1.3.4 如何抵抗宿主免疫杀伤 | 第20页 |
| 1.1.4 迟缓爱德华氏菌的防治 | 第20-21页 |
| 1.1.4.1 抗生素 | 第20页 |
| 1.1.4.2 疫苗 | 第20-21页 |
| 1.2 细菌荚膜 | 第21-22页 |
| 1.2.1 荚膜的化学结构 | 第21页 |
| 1.2.2 荚膜合成相关基因 | 第21-22页 |
| 1.2.3 荚膜的致病作用 | 第22页 |
| 1.2.4 迟缓爱德华氏菌荚膜 | 第22页 |
| 1.3 Rcs 双组分调节系统 | 第22-24页 |
| 1.3.1 Rcs 双组分调节系统的组成 | 第22-23页 |
| 1.3.2 Rcs 双组分调节系统的生物学功能 | 第23-24页 |
| 1.4 可拉酸（colanic acid） | 第24-27页 |
| 1.4.1 可拉酸的结构及生物功能 | 第24-25页 |
| 1.4.2 wcaJ 在可拉酸合成中的作用 | 第25-26页 |
| 1.4.3 cpsB 在可拉酸合成中的作用 | 第26-27页 |
| 1.5 本论文研究的目的与意义 | 第27-28页 |
| 2 迟缓爱德华氏菌 Rcs 双组分系统应答调节子 rcsB 基因的功能研究 | 第28-57页 |
| 摘要 | 第28页 |
| 引言 | 第28-29页 |
| 2.1 实验材料 | 第29-33页 |
| 2.1.1 实验菌株、质粒、细胞与实验动物 | 第29-30页 |
| 2.1.2 培养条件、试剂与仪器 | 第30-33页 |
| 2.2 实验方法 | 第33-46页 |
| 2.2.1 同源重组介导的基因敲除 | 第33-39页 |
| 2.2.1.2 rcsB 基因缺失片段的构建 | 第35-37页 |
| 2.2.1.3 重组质粒 pUCmDrcsB 的构建 | 第37页 |
| 2.2.1.4 重组自杀质粒的构建 | 第37-38页 |
| 2.2.1.5 一次同源重组 | 第38页 |
| 2.2.1.6 二次同源重组及突变株稳定性检测 | 第38-39页 |
| 2.2.2 互补菌株的构建（ΔrcsB (pACYC184K-rcsB)） | 第39-40页 |
| 2.2.3 荧光定量 PCR 检测互补菌株（ΔrcsB (pACYC184K-rcsB)）中 rcsB 基因表达情况 | 第40-42页 |
| 2.2.3.1 细菌总 RNA 的提取 | 第40-41页 |
| 2.2.3.2 消化样品中的 DNA | 第41页 |
| 2.2.3.3 RNA 的反转录 | 第41-42页 |
| 2.2.3.4 cDNA 为模板的荧光定量 PCR | 第42页 |
| 2.2.4 迟缓爱德华氏菌的荚膜诱导及染色 | 第42-43页 |
| 2.2.5 对 EPC 细胞吸附率和内化率的检测 | 第43-44页 |
| 2.2.6 胚胎浸泡实验 | 第44页 |
| 2.2.7 细菌生长曲线的测定 | 第44页 |
| 2.2.8 体外生物被膜检测 | 第44-45页 |
| 2.2.9 自凝实验 | 第45页 |
| 2.2.10 脂多糖检测 | 第45-46页 |
| 2.3 实验结果 | 第46-53页 |
| 2.3.1 同源重组介导的基因敲除 | 第46-48页 |
| 2.3.1.1 DrcsB 片段的构建 | 第46页 |
| 2.3.1.2 重组自杀质粒的构建 | 第46页 |
| 2.3.1.3 一次同源重组 | 第46-47页 |
| 2.3.1.4 二次同源重组及突变株ΔrcsB 稳定性检测 | 第47-48页 |
| 2.3.2 互补菌株的构建（ΔrcsB (pACYC184K-rcsB)） | 第48页 |
| 2.3.3 荧光定量 PCR 检测 rcsB 在互补株的表达情况 | 第48页 |
| 2.3.4 荚膜诱导及染色 | 第48-49页 |
| 2.3.5 吸附率及内化率的检测 | 第49-50页 |
| 2.3.6 E. tarda 对斑马鱼胚胎的毒力检测 | 第50页 |
| 2.3.7 rcsB 对细菌生长的影响 | 第50-51页 |
| 2.3.8 rcsB 对细菌生物被膜形成能力的影响 | 第51-52页 |
| 2.3.9 rcsB 对细菌自凝的影响 | 第52-53页 |
| 2.3.10 rcsB 对细菌脂多糖形成能力的影响 | 第53页 |
| 2.4 讨论 | 第53-56页 |
| 2.4.1 缺失突变株ΔrcsB 及互补株ΔrcsB (pACYC184K-rcsB)的构建 | 第54页 |
| 2.4.2 rcsB 对细菌致病性的影响 | 第54-55页 |
| 2.4.3 rcsB 对细菌致病相关表型的影响 | 第55-56页 |
| 2.5 小结 | 第56-57页 |
| 3 迟缓爱德华氏菌可拉酸合成途径中 wcaJ 基因的功能研究 | 第57-75页 |
| 摘要 | 第57页 |
| 引言 | 第57-58页 |
| 3.1 实验材料 | 第58-59页 |
| 3.1.1 实验菌株、质粒、细胞与实验动物 | 第58-59页 |
| 3.1.2 培养条件、试剂与仪器 | 第59页 |
| 3.2 实验方法 | 第59-64页 |
| 3.2.1 同源重组介导的基因敲除 | 第59-63页 |
| 3.2.1.1 引物设计 | 第60-61页 |
| 3.2.1.2 DwcaJ 的构建 | 第61-62页 |
| 3.2.1.3 重组质粒 pUCmDwcaJ 的构建 | 第62页 |
| 3.2.1.4 重组自杀质粒的构建 | 第62页 |
| 3.2.1.5 一次同源重组 | 第62页 |
| 3.2.1.6 二次同源重组及突变株稳定性检测 | 第62-63页 |
| 3.2.2 互补菌株的构建（ΔwcaJ (pACYC184K-wcaJ)） | 第63页 |
| 3.2.3 荧光定量 PCR 检测互补菌株（ΔwcaJ (pACYC184K-wcaJ)）中 wcaJ 基因表达情况 | 第63页 |
| 3.2.4 荚膜诱导及染色 | 第63页 |
| 3.2.5 对 EPC 细胞吸附率和内化率的检测 | 第63页 |
| 3.2.6 胚胎浸泡实验 | 第63页 |
| 3.2.7 细菌生长曲线的测定 | 第63页 |
| 3.2.8 体外生物被膜检测 | 第63-64页 |
| 3.2.9 自凝实验 | 第64页 |
| 3.2.10 脂多糖检测 | 第64页 |
| 3.3 实验结果 | 第64-72页 |
| 3.3.1 缺失突变株的构建 | 第64-65页 |
| 3.3.2 互补菌株ΔwcaJ (pACYC184K-wcaJ)的构建 | 第65-66页 |
| 3.3.3 荧光定量 PCR 检测 wcaJ 在互补株的表达情况 | 第66页 |
| 3.3.4 荚膜诱导及染色 | 第66-67页 |
| 3.3.5 吸附率及内化率的检测 | 第67页 |
| 3.3.6 E. tarda 对斑马鱼胚胎的毒力检测 | 第67-68页 |
| 3.3.7 wcaJ 对细菌生长的影响 | 第68-69页 |
| 3.3.8 wcaJ 对细菌生物被膜形成能力的影响 | 第69-70页 |
| 3.3.9 wcaJ 对细菌自凝的影响 | 第70-71页 |
| 3.3.10 wcaJ 对细菌脂多糖形成能力检测 | 第71-72页 |
| 3.3.10.1 脂多糖的提取及 SDS-PAGE 检测 | 第71页 |
| 3.3.10.2 脂多糖的定量实验 | 第71-72页 |
| 3.4 讨论 | 第72-74页 |
| 3.4.1 缺失突变株ΔwcaJ 及互补株ΔwcaJ (pACYC184K-wcaJ)的构建 | 第72页 |
| 3.4.2 wcaJ 对细菌致病相关表型的影响 | 第72-73页 |
| 3.4.3 wcaJ 对细菌致病性的影响 | 第73-74页 |
| 3.5 小结 | 第74-75页 |
| 4 迟缓爱德华氏菌可拉酸合成途径中 cpsB 基因的功能研究 | 第75-92页 |
| 摘要 | 第75页 |
| 引言 | 第75-76页 |
| 4.1 实验材料 | 第76-77页 |
| 4.1.1 实验菌株、质粒、细胞与实验动物 | 第76-77页 |
| 4.1.2 培养条件、试剂与仪器 | 第77页 |
| 4.2 实验方法 | 第77-82页 |
| 4.2.1 同源重组介导的基因敲除 | 第77-81页 |
| 4.2.1.1 引物设计 | 第78-79页 |
| 4.2.1.2 cpsB 基因缺失片段的构建 | 第79-80页 |
| 4.2.1.3 重组质粒 pUCmDcpsB 的构建 | 第80页 |
| 4.2.1.4 重组自杀质粒的构建 | 第80页 |
| 4.2.1.5 一次同源重组 | 第80页 |
| 4.2.1.6 二次同源重组及突变株稳定性检测 | 第80-81页 |
| 4.2.2 互补菌株的构建（ΔcpsB (pACYC184K-cpsB)） | 第81页 |
| 4.2.3 荧光定量 PCR 检测互补菌株（ΔcpsB (pACYC184K-cpsB)）中 cpsB 基因表达情况 | 第81页 |
| 4.2.4 荚膜诱导及染色 | 第81页 |
| 4.2.5 对 EPC 细胞吸附率和内化率的检测 | 第81页 |
| 4.2.6 胚胎浸泡实验 | 第81页 |
| 4.2.7 细菌生长曲线的测定 | 第81页 |
| 4.2.8 体外生物被膜检测 | 第81-82页 |
| 4.2.9 自凝实验 | 第82页 |
| 4.2.10 脂多糖检测 | 第82页 |
| 4.2.10.1 脂多糖的提取及 SDS-PAGE 检测 | 第82页 |
| 4.2.10.2 脂多糖的提取及定量检测 | 第82页 |
| 4.3 实验结果 | 第82-89页 |
| 4.3.1 缺失突变株的构建 | 第82-83页 |
| 4.3.2 互补菌株 ΔcpsB (pACYC184K-cpsB)的构建 | 第83页 |
| 4.3.3 荧光定量 PCR 检测 cpsB 在互补株的表达情况 | 第83-84页 |
| 4.3.4 荚膜诱导及染色 | 第84页 |
| 4.3.5 吸附率及内化率的检测 | 第84-85页 |
| 4.3.6 E. tarda 对斑马鱼胚胎的毒力检测 | 第85-86页 |
| 4.3.7 cpsB 对细菌生长的影响 | 第86-87页 |
| 4.3.8 cpsB 对细菌生物被膜形成能力的影响 | 第87页 |
| 4.3.9 cpsB 对细菌自凝的影响 | 第87-88页 |
| 4.3.10 cpsB 对细菌脂多糖形成能力检测 | 第88-89页 |
| 4.3.10.1 脂多糖的提取及 SDS-PAGE 检测 | 第88-89页 |
| 4.3.10.2 脂多糖的定量实验 | 第89页 |
| 4.4 讨论 | 第89-91页 |
| 4.4.1 缺失突变株 ΔcpsB 及互补株 ΔcpsB (pACYC184K-cpsB)的构建 | 第89页 |
| 4.4.2 cpsB 对细菌致病相关表型的影响 | 第89-90页 |
| 4.4.3 cpsB 对细菌致病性的影响 | 第90-91页 |
| 4.5 小结 | 第91-92页 |
| 5 | 第92-94页 |
| 5.1 主要结论 | 第92-93页 |
| 5.2 主要创新点 | 第93-94页 |
| 参考文献 | 第94-105页 |
| 附录 主要试剂配方 | 第105-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 个人简历 | 第108页 |
| 攻读硕士学位期间发表及参与发表的学术论文 | 第108-109页 |
