| 中文摘要 | 第6-7页 |
| ABSTRACT | 第7页 |
| 第一章 前言 | 第8-12页 |
| 1 结核病全球流行,形势严峻 | 第8页 |
| 2 易错DNA聚合酶DnaE2与细菌的抗药性相关 | 第8页 |
| 3 结核分枝杆菌中与基因突变相关的DNA聚合酶—DnaE2 | 第8-9页 |
| 4 细菌的SOS修复机制 | 第9页 |
| 5 结核分枝杆菌ArsR-SmtB家族的转录因子 | 第9-11页 |
| 6 背景与意义 | 第11-12页 |
| 6.1 本课题的背景 | 第11页 |
| 6.2 本课题的研究内容 | 第11页 |
| 6.3 本课题的目标与意义 | 第11-12页 |
| 第二章 材料与方法 | 第12-23页 |
| 1 实验材料 | 第12-15页 |
| 1.1 供试菌株和质粒 | 第12页 |
| 1.1.1 实验所用菌株 | 第12页 |
| 1.1.2 实验所用质粒 | 第12页 |
| 1.2 酶、抗生素和引物合成 | 第12页 |
| 1.3 其余缓冲液、试剂 | 第12-14页 |
| 1.3.1 基本分子生物学试剂 | 第12-14页 |
| 1.3.2 蛋白质纯化试剂 | 第14页 |
| 1.3.2.1 Ni~(2+)-nitrilotriacetate亲和纯化缓冲液: | 第14页 |
| 1.3.2.2 GST亲和纯化缓冲液: | 第14页 |
| 1.3.3 Ch-IP染色质免疫沉淀试剂 | 第14页 |
| 1.4 培养基 | 第14-15页 |
| 1.5 引物及寡核苷酸 | 第15页 |
| 2 实验方法 | 第15-23页 |
| 2.1 分子生物学基本操作 | 第15页 |
| 2.2 细菌单杂交实验 | 第15-16页 |
| 2.2.1 配制单杂交筛选培养基 | 第15-16页 |
| 2.2.2 细菌单杂交质粒的构建 | 第16页 |
| 2.3 His标签蛋白和GST标签蛋白的亲和纯化 | 第16-18页 |
| 2.3.1 表达载体的构建 | 第16-17页 |
| 2.3.2 IPTG诱导蛋白质表达 | 第17页 |
| 2.3.3 含有6His融合标签蛋白的亲和纯化 | 第17页 |
| 2.3.4 含有GST融合标签的亲和纯化 | 第17-18页 |
| 2.3.5 蛋白的透析 | 第18页 |
| 2.4 凝胶阻滞迁移分析(EMSA) | 第18-19页 |
| 2.4.1 琼脂糖EMSA | 第18-19页 |
| 2.4.2 同位素EMSA | 第19页 |
| 2.5 Ch-IP染色质免疫沉淀 | 第19-20页 |
| 2.6 敲除载体和互补型载体的构建和耻垢分支杆菌nmtR基因的敲除 | 第20-21页 |
| 2.6.1 构建敲除载体 | 第20页 |
| 2.6.2 构建互补型载体 | 第20-21页 |
| 2.6.3 耻垢分支杆菌nmtR基因的敲除 | 第21页 |
| 2.6.4 耻垢分支杆菌MsmΔnmtR的互补型构建 | 第21页 |
| 2.7 紫外线诱变耻垢分支杆菌测其基因突变频率 | 第21-22页 |
| 2.8 qRT-PCR | 第22-23页 |
| 2.8.1 RNA抽提 | 第22页 |
| 2.8.2 反转录 | 第22页 |
| 2.8.3 Real Time-PCR | 第22-23页 |
| 第三章 结果与分析 | 第23-38页 |
| 1 体内探测转录因子NmtR和dnaE2R的相互作用 | 第23-25页 |
| 1.1 细菌单杂交共转化菌株的构建 | 第23页 |
| 1.2 利用单杂交系统检测蛋白质与启动子DNA的相互作用 | 第23-24页 |
| 1.3 Ch-IP染色质免疫沉淀 | 第24-25页 |
| 2 在体外验证NmtR和dnaE2R的相互作用 | 第25-29页 |
| 2.1 蛋白质的表达纯化 | 第25页 |
| 2.2 琼脂糖EMSA验证MsmNmtR和MsmdnaE2R在体外的相互作用 | 第25-27页 |
| 2.3 同位素EMSA验证MsmNmtR和MsmdnaE2R的特异性相互作用 | 第27-28页 |
| 2.4 MsmNmtR和MsmdnaE2R的相互作用受到锌离子、镍离子的抑制 | 第28-29页 |
| 3 在体外验证LexA、SigB、RegX3和dnaE2R的相互作用 | 第29-33页 |
| 3.1 蛋白质的表达纯化 | 第29-30页 |
| 3.2 单杂交验证 | 第30-31页 |
| 3.3 琼脂糖EMSA | 第31-33页 |
| 3.4 同位素EMSA | 第33页 |
| 4 MsmnmtR基因的敲除与dnaE2所介导的抗药性之间的关系 | 第33-38页 |
| 4.1 MsmnmtR基因的敲除载体的构建与MsmnmtR基因的敲除 | 第33-34页 |
| 4.2 紫外诱变测突变率验证敲除菌株与野生型菌株的抗药性差异 | 第34-36页 |
| 4.3 敲除菌株与野生型菌株的dnaE2和nmtR在体内转录与表达的差异 | 第36-38页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第38-40页 |
| 1 总结 | 第38页 |
| 2 讨论 | 第38-40页 |
| 参考文献 | 第40-45页 |
| 致谢 | 第45页 |
