| 摘要 | 第3-4页 |
| ABSTRACT | 第4页 |
| 第一章 文献综述 | 第8-24页 |
| 1.1 B.subtilis的σ~A启动子 | 第8-14页 |
| 1.1.1 σ~A 启动子的结构和功能 | 第8-10页 |
| 1.1.1.1 -10 区和-35 区 | 第8-9页 |
| 1.1.1.2 -16 区 | 第9页 |
| 1.1.1.3 UP元件 | 第9-10页 |
| 1.1.2 σ~A 启动子的转录起始机制 | 第10-11页 |
| 1.1.2.1 RNA多聚酶 | 第10页 |
| 1.1.2.2 σ~A 启动子的转录起始 | 第10页 |
| 1.1.2.3 σ~A 启动子的强弱 | 第10-11页 |
| 1.1.3 B. subtilis的若干σ~A启动子 | 第11-14页 |
| 1.1.3.1 P43 启动子 | 第11-12页 |
| 1.1.3.2 xylA启动子 | 第12-13页 |
| 1.1.3.3 amyQ启动子 | 第13页 |
| 1.1.3.4 噬菌体Φ29 的A1 启动子 | 第13-14页 |
| 1.2 B. subtilis mRNA的稳定机制 | 第14-19页 |
| 1.2.1 B. subtilis mRNA的降解机制 | 第15页 |
| 1.2.2 emrC mRNA的稳定机制 | 第15-17页 |
| 1.2.3 cry3A mRNA的稳定机制 | 第17-18页 |
| 1.2.4 aprE mRNA的稳定机制 | 第18-19页 |
| 1.3 启动子和稳定子在B. subtilis基因工程中的应用 | 第19-21页 |
| 1.3.1 B.subtilis的特点 | 第19页 |
| 1.3.2 B.subtilis产核黄素基因工程菌 | 第19-20页 |
| 1.3.3 B.subtilis产透明质酸基因工程菌 | 第20页 |
| 1.3.4 B.subtilis产木聚糖酶基因工程菌 | 第20-21页 |
| 1.3.5 B.subtilis产脂肪酶基因工程菌 | 第21页 |
| 1.4 B.subtilis的lipA基因及其编码产物 | 第21-22页 |
| 1.5 本课题的研究内容和目的 | 第22-24页 |
| 第二章 材料与方法 | 第24-37页 |
| 2.1 实验材料 | 第24-29页 |
| 2.1.1 菌株和质粒 | 第24页 |
| 2.1.2 主要药品 | 第24-26页 |
| 2.1.3 主要试剂 | 第26-27页 |
| 2.1.4 培养基 | 第27页 |
| 2.1.5 主要仪器 | 第27-28页 |
| 2.1.6 PCR引物 | 第28-29页 |
| 2.2 实验方法 | 第29-37页 |
| 2.2.1 B.subtilis染色体DNA提取 | 第29-30页 |
| 2.2.2 质粒的小规模提取（CTAB法） | 第30页 |
| 2.2.3 普通PCR扩增 | 第30-31页 |
| 2.2.4 三个DNA片段的重叠PCR拼接 | 第31-33页 |
| 2.2.5 DNA片段的切胶回收 | 第33页 |
| 2.2.6 DNA片段的浓缩 | 第33页 |
| 2.2.7 DNA片段的去磷酸化处理 | 第33-34页 |
| 2.2.8 DNA片段A尾的添加 | 第34页 |
| 2.2.9 DNA的酶切 | 第34页 |
| 2.2.10 T1 载体与DNA的连接反应 | 第34-35页 |
| 2.2.11 琼脂糖凝胶电泳 | 第35页 |
| 2.2.12 E.coli感受态细胞的制备 | 第35页 |
| 2.2.13 E.coli感受态细胞的转化 | 第35-36页 |
| 2.2.14 B.subtilis的Spizizen转化 | 第36页 |
| 2.2.15 DNA的纯化 | 第36-37页 |
| 第三章 结果与讨论 | 第37-61页 |
| 3.1 lipA基因表达元件的修饰方案 | 第37-38页 |
| 3.2 lipA缺陷菌的构建 | 第38-45页 |
| 3.2.1 PCR扩增Lu、Ld和E片段 | 第39页 |
| 3.2.2 两步法重叠 PCR拼接LE片段 | 第39-41页 |
| 3.2.3 重组质粒pT1-LE的构建 | 第41-42页 |
| 3.2.4 重组质粒pT1-LE的转化及转化子的验证 | 第42-45页 |
| 3.3 lipA~+菌株的筛选方法 | 第45-50页 |
| 3.3.1 橄榄油基本培养基的生长 | 第45-46页 |
| 3.3.2 重组质粒pT1-LA的构建及其验证 | 第46-49页 |
| 3.3.3 橄榄油基本培养基的对lipA+转化子的选择作用 | 第49-50页 |
| 3.4 重组质粒pT1-PAs的构建 | 第50-55页 |
| 3.4.1 PCR扩增LU、LP和PAs片段 | 第50-52页 |
| 3.4.2 两步法重叠 PCR拼接LPAS片段 | 第52页 |
| 3.4.3 重组质粒pT1-PAs的构建 | 第52-54页 |
| 3.4.4 重组质粒pT1-PAs的测序 | 第54-55页 |
| 3.5 重组质粒pT1-PAs转化D8104E | 第55页 |
| 3.6 重组质粒pT1-CP的构建 | 第55-61页 |
| 3.6.1 PCR扩增C片段 | 第55-56页 |
| 3.6.2 pT1-PAs和C片段的连接和转化 | 第56-58页 |
| 3.6.3 LC片段的构建 | 第58-61页 |
| 第四章 结论与展望 | 第61-63页 |
| 4.1 结论 | 第61页 |
| 4.2 展望 | 第61-63页 |
| 参考文献 | 第63-67页 |
| 致谢 | 第67-68页 |
| 附件 | 第68页 |
