| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 第一章 引言 | 第24-44页 |
| 1.1 果胶 | 第24-25页 |
| 1.2 果胶酶 | 第25-28页 |
| 1.2.1 果胶酶的分类 | 第25-26页 |
| 1.2.2 果胶酶的应用 | 第26-28页 |
| 1.3 多聚半乳糖醛酸酶的研究进展 | 第28-40页 |
| 1.3.1 多聚半乳糖醛酸酶的功能 | 第28页 |
| 1.3.2 多聚半乳糖醛酸酶的来源 | 第28页 |
| 1.3.3 多聚半乳糖醛酸酶的性质 | 第28-33页 |
| 1.3.4 多聚半乳糖醛酸酶的一级结构特征 | 第33-34页 |
| 1.3.5 多聚半乳糖醛酸酶的三级结构特征 | 第34-36页 |
| 1.3.6 多聚半乳糖醛酸酶中的二硫键 | 第36-37页 |
| 1.3.7 糖基化修饰 | 第37页 |
| 1.3.8 多聚半乳糖醛酸酶的催化机制 | 第37-38页 |
| 1.3.9 多聚半乳糖醛酸酶与底物的结合模式 | 第38-39页 |
| 1.3.10 多聚半乳糖醛酸酶的底物切割模式 | 第39-40页 |
| 1.4 活性loop区 | 第40-43页 |
| 1.5 本研究的目的和意义 | 第43-44页 |
| 第二章 高比活多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、酶学性质及其结构解析 | 第44-65页 |
| 2.1 实验材料 | 第44-45页 |
| 2.1.1 菌株和异源表达载体 | 第44页 |
| 2.1.2 培养基和溶液 | 第44页 |
| 2.1.3 实验仪器 | 第44-45页 |
| 2.1.4 引物合成与核酸测序 | 第45页 |
| 2.1.5 生化试剂、试剂盒和工具酶 | 第45页 |
| 2.2 实验方法 | 第45-53页 |
| 2.2.1 Achaetomium sp. Xz8菌株产多聚半乳糖醛酸酶活性评估 | 第45页 |
| 2.2.2 多聚半乳糖醛酸酶基因全长序列的扩增 | 第45-48页 |
| 2.2.3 多聚半乳糖醛酸酶基因cDNA序列的扩增 | 第48-49页 |
| 2.2.4 基因PG8fn异源表达载体的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.5 基因PG8fn的表达 | 第50-51页 |
| 2.2.6 重组多聚半乳糖醛酸酶PG8fn的纯化 | 第51页 |
| 2.2.7 PG8fn的酶学性质分析 | 第51-52页 |
| 2.2.8 PG8fn对木瓜果汁的澄清试验 | 第52页 |
| 2.2.9 PG8fn晶体结构解析 | 第52-53页 |
| 2.3 结果与分析 | 第53-62页 |
| 2.3.1 PG8fn编码基因的克隆、序列分析 | 第53-55页 |
| 2.3.2 PG8fn的异源表达和纯化 | 第55-57页 |
| 2.3.3 PG8fn的酶学性质分析 | 第57-59页 |
| 2.3.4 PG8fn对木瓜果汁的澄清试验结果和分析 | 第59页 |
| 2.3.5 PG8fn晶体结构分析 | 第59-62页 |
| 2.4 讨论 | 第62-64页 |
| 2.5 本章小结 | 第64-65页 |
| 第三章 基于表面电荷分布的优化对PG8fn进行热稳定性改良 | 第65-77页 |
| 3.1 实验材料 | 第65页 |
| 3.1.1 质粒和异源表达载体 | 第65页 |
| 3.1.2 培养基和溶液 | 第65页 |
| 3.1.3 实验仪器 | 第65页 |
| 3.1.4 引物合成与核酸测序 | 第65页 |
| 3.1.5 生化试剂、试剂盒和工具酶 | 第65页 |
| 3.2 实验方法 | 第65-68页 |
| 3.2.1 突变位点的选择 | 第65-66页 |
| 3.2.2 定点突变试验 | 第66-67页 |
| 3.2.3 各突变体表达载体的构建 | 第67页 |
| 3.2.4 各突变体的表达及纯化 | 第67页 |
| 3.2.5 各突变体的酶学性质分析 | 第67-68页 |
| 3.2.6 分子动力学模拟 | 第68页 |
| 3.3 结果与分析 | 第68-74页 |
| 3.3.1 突变位点的选择 | 第68-69页 |
| 3.3.2 各突变体的表达与纯化 | 第69-70页 |
| 3.3.3 pH值及溶液离子强度对酶活的影响 | 第70-71页 |
| 3.3.4 各突变体的耐热性分析 | 第71-72页 |
| 3.3.5 DSC分析 | 第72-73页 |
| 3.3.6 MD分析 | 第73-74页 |
| 3.4 讨论 | 第74-76页 |
| 3.5 本章小结 | 第76-77页 |
| 第四章 T3 loop区上底物结合位点对催化效率影响的研究 | 第77-90页 |
| 4.1 实验材料 | 第78-79页 |
| 4.1.1 质粒和异源表达载体 | 第78页 |
| 4.1.2 培养基和溶液 | 第78页 |
| 4.1.3 实验仪器 | 第78页 |
| 4.1.4 引物合成与核酸测序 | 第78页 |
| 4.1.5 生化试剂、试剂盒和工具酶 | 第78-79页 |
| 4.2 实验方法 | 第79-80页 |
| 4.2.1 分子对接 | 第79页 |
| 4.2.2 分子动力学模拟 | 第79页 |
| 4.2.3 T3 loop区序列分析 | 第79页 |
| 4.2.4 定点突变试验 | 第79-80页 |
| 4.2.5 各突变体表达载体的构建 | 第80页 |
| 4.2.6 各突变体的表达及纯化 | 第80页 |
| 4.2.7 动力学常数的测定 | 第80页 |
| 4.3 结果与分析 | 第80-87页 |
| 4.3.1 PG8fn与寡糖GalpA5的结合构象 | 第80-82页 |
| 4.3.2 分子动力学模拟 | 第82-86页 |
| 4.3.3 T3 loop区序列保守性分析 | 第86页 |
| 4.3.4 各突变体的表达与纯化 | 第86页 |
| 4.3.5 各突变体动力学常数的测定 | 第86-87页 |
| 4.4 讨论 | 第87-89页 |
| 4.5 本章小结 | 第89-90页 |
| 第五章 T3 loop区上底物二级结合位点对催化效率影响的研究 | 第90-103页 |
| 5.1 实验材料 | 第90页 |
| 5.1.1 质粒和异源表达载体 | 第90页 |
| 5.1.2 培养基和溶液 | 第90页 |
| 5.1.3 实验仪器 | 第90页 |
| 5.1.4 序列、引物合成与核酸测序 | 第90页 |
| 5.1.5 生化试剂、试剂盒和工具酶 | 第90页 |
| 5.2 实验方法 | 第90-93页 |
| 5.2.1 差异序列的选择 | 第90页 |
| 5.2.2 CluPG1编码基因的克隆、异源表达、纯化及动力学常数测定 | 第90-91页 |
| 5.2.3 CluPG1定点突变试验 | 第91页 |
| 5.2.4 PG8fn定点饱和突变试验 | 第91页 |
| 5.2.5 各突变体表达载体的构建 | 第91页 |
| 5.2.6 各突变体的表达及纯化 | 第91页 |
| 5.2.7 动力学常数的测定 | 第91页 |
| 5.2.8 各突变体及野生酶与寡糖的亲和力分析 | 第91-92页 |
| 5.2.9 分子对接 | 第92页 |
| 5.2.10 分子动力学模拟 | 第92页 |
| 5.2.11 MM/PBSA计算结合自由能 | 第92-93页 |
| 5.3 结果与分析 | 第93-100页 |
| 5.3.1 PG8fn与CluPG1序列分析 | 第93-94页 |
| 5.3.2 PG8fn与CluPG1结构比对 | 第94-95页 |
| 5.3.3 CluPG1定点突变试验 | 第95-96页 |
| 5.3.4 PG8fn定点饱和突变试验 | 第96-97页 |
| 5.3.5 各突变体及野生酶PG8fn与寡糖的亲和力分析 | 第97页 |
| 5.3.6 分子对接 | 第97-99页 |
| 5.3.7 分子动力学模拟 | 第99-100页 |
| 5.4 讨论 | 第100-102页 |
| 5.5 本章小结 | 第102-103页 |
| 第六章 T3 loop区上非活性位点对催化效率影响的研究 | 第103-118页 |
| 6.1 实验材料 | 第103页 |
| 6.1.1 质粒和异源表达载体 | 第103页 |
| 6.1.2 培养基和溶液 | 第103页 |
| 6.1.3 实验仪器 | 第103页 |
| 6.1.4 引物合成与核酸测序 | 第103页 |
| 6.1.5 生化试剂、试剂盒和工具酶 | 第103页 |
| 6.2 实验方法 | 第103-106页 |
| 6.2.1 突变位点的选择 | 第103-104页 |
| 6.2.2 定点突变试验 | 第104页 |
| 6.2.3 各突变体表达载体的构建 | 第104页 |
| 6.2.4 各突变体的表达及纯化 | 第104页 |
| 6.2.5 动力学常数的测定 | 第104-105页 |
| 6.2.6 Arg113在其他GH28多聚半乳糖醛酸酶中效果验证 | 第105页 |
| 6.2.7 分子对接 | 第105页 |
| 6.2.8 分子动力学模拟 | 第105-106页 |
| 6.2.9 分子动力学模拟轨迹分析 | 第106页 |
| 6.3 结果与分析 | 第106-115页 |
| 6.3.1 突变位点的选择 | 第106-108页 |
| 6.3.2 113位点氨基酸突变对催化效率的影响 | 第108-109页 |
| 6.3.3 突变体T113R和野生酶PG8fn的分子动力学模拟 | 第109-111页 |
| 6.3.4 突变体T113R和野生酶PG8fn模拟轨迹中的通道分析 | 第111-113页 |
| 6.3.5 分子对接结果 | 第113页 |
| 6.3.6 GalpA2与突变体T113R及野生酶PG8fn复合物体系动力学分析 | 第113-115页 |
| 6.4 讨论 | 第115-117页 |
| 6.5 本章小结 | 第117-118页 |
| 第七章 基于PG8fn结构特征指导多聚半乳糖醛酸酶分子改良 | 第118-135页 |
| 7.1 实验材料 | 第118-119页 |
| 7.1.1 质粒和异源表达载体 | 第118页 |
| 7.1.2 培养基和溶液 | 第118-119页 |
| 7.1.3 实验仪器 | 第119页 |
| 7.1.4 引物合成与核酸测序 | 第119页 |
| 7.1.5 生化试剂、试剂盒和工具酶 | 第119页 |
| 7.2 实验方法 | 第119-122页 |
| 7.2.1 PG63同源建模 | 第119页 |
| 7.2.2 突变位点的选择 | 第119页 |
| 7.2.3 定点突变试验 | 第119页 |
| 7.2.4 各突变体表达载体的构建 | 第119页 |
| 7.2.5 各突变体的表达及纯化 | 第119-120页 |
| 7.2.6 最适温度及热稳定性 | 第120页 |
| 7.2.7 动力学常数的测定 | 第120-121页 |
| 7.2.8 各突变体Tm值的测定 | 第121页 |
| 7.2.9 各突变体及野生酶与寡糖的亲和力分析 | 第121页 |
| 7.2.10 产物分析 | 第121页 |
| 7.2.11 分子对接 | 第121页 |
| 7.2.12 分子动力学模拟 | 第121-122页 |
| 7.3 结果与分析 | 第122-132页 |
| 7.3.1 突变位点的选择 | 第122-123页 |
| 7.3.2 各突变体的表达与纯化 | 第123-124页 |
| 7.3.3 各突变体的耐热性分析 | 第124-125页 |
| 7.3.4 各突变体的动力学常数的测定 | 第125页 |
| 7.3.5 各突变体及野生酶与寡糖的亲和力分析 | 第125-126页 |
| 7.3.6 产物分析 | 第126-128页 |
| 7.3.7 分子对接 | 第128-129页 |
| 7.3.8 分子动力学模拟 | 第129-132页 |
| 7.4 讨论 | 第132-134页 |
| 7.5 本章小结 | 第134-135页 |
| 第八章 全文结论 | 第135-137页 |
| 参考文献 | 第137-151页 |
| 附录 | 第151-152页 |
| 致谢 | 第152-153页 |
| 作者简历 | 第153-154页 |
