| 摘要 | 第4-6页 |
| Abstract | 第6-7页 |
| 1 前言 | 第13-25页 |
| 1.1 植物无机焦磷酸酶研究 | 第13-19页 |
| 1.1.1 膜结合焦磷酸酶 | 第13-15页 |
| 1.1.1.1 H~+-PPases蛋白的特性和分子结构 | 第13-14页 |
| 1.1.1.2 H~+-PPase表达调控研究 | 第14-15页 |
| 1.1.1.3 H~+-PPase基因工程研究 | 第15页 |
| 1.1.2 可溶性无机焦磷酸酶 | 第15-18页 |
| 1.1.2.1 sPPase蛋白的特性和分子结构 | 第15页 |
| 1.1.2.2 sPPase基因研究 | 第15-16页 |
| 1.1.2.3 sPPase表达调控研究 | 第16-17页 |
| 1.1.2.4 sPPase基因工程研究 | 第17-18页 |
| 1.1.3 橡胶树中的焦磷酸酶研究 | 第18-19页 |
| 1.2 天然橡胶生物合成及调控机理研究 | 第19-23页 |
| 1.2.1 天然橡胶生物合成途径 | 第19-20页 |
| 1.2.2 乙烯对天然橡胶生物合成调控 | 第20-21页 |
| 1.2.3 茉莉酸在天然橡胶生物合成中的调控作用 | 第21页 |
| 1.2.4 橡胶生物合成关键酶及相关基因 | 第21-23页 |
| 1.3 目的和意义 | 第23-24页 |
| 1.4 本研究的技术路线 | 第24-25页 |
| 2 材料与方法 | 第25-58页 |
| 2.1 材料与试剂 | 第25-26页 |
| 2.1.1 材料 | 第25页 |
| 2.1.2 质粒及菌种 | 第25页 |
| 2.1.3 试剂 | 第25-26页 |
| 2.2 方法与步骤 | 第26-58页 |
| 2.2.1 橡胶树Total RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.1.1 实验器材处理 | 第26页 |
| 2.2.1.2 橡胶树叶片总RNA的提取 | 第26-27页 |
| 2.2.1.3 橡胶树胶乳总RNA的提取 | 第27页 |
| 2.2.1.4 DNA第一链的合成 | 第27页 |
| 2.2.2 HbSIP1/2/3的分离 | 第27-34页 |
| 2.2.2.1 5'RACE分别扩增HbSIP1和HbSIP2的5'端 | 第27-31页 |
| 2.2.2.2 HbSIP3保守区的克隆 | 第31-32页 |
| 2.2.2.3 HbSIP3的5'端和3'端的扩增 | 第32-33页 |
| 2.2.2.4 HbSIP1/2/3全长序列的扩增 | 第33-34页 |
| 2.2.3 HbSIP1/2/3结构分析 | 第34-36页 |
| 2.2.3.1 橡胶树基因组DNA的提取 | 第34页 |
| 2.2.3.2 HbSIP1/2/3 DNA序列的扩增 | 第34-35页 |
| 2.2.3.3 目的片段的回收 | 第35-36页 |
| 2.2.3.4 目的片段的克隆与重组子的筛选鉴定 | 第36页 |
| 2.2.4 HbSIP1/2/3生物信息学分析 | 第36页 |
| 2.2.5 HbSIP1/2/3酶学特征分析 | 第36-41页 |
| 2.2.5.1 原核表达载体构建 | 第36-37页 |
| 2.2.5.2 原核表达 | 第37-38页 |
| 2.2.5.3 Western杂交 | 第38-39页 |
| 2.2.5.4 蛋白纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.5.5 蛋白含量测定 | 第40页 |
| 2.2.5.6 酶活性测定 | 第40页 |
| 2.2.5.7 酶活性单位的定义 | 第40-41页 |
| 2.2.5.8 酶动力学特征分析 | 第41页 |
| 2.2.6 HbSIP/1/2/3的表达分析 | 第41-42页 |
| 2.2.6.1 材料处理 | 第41页 |
| 2.2.6.2 RNA的提取 | 第41页 |
| 2.2.6.3 cDNA第一链的合成 | 第41-42页 |
| 2.2.6.4 引物设计 | 第42页 |
| 2.2.6.5 荧光定量PCR分析基因表达 | 第42页 |
| 2.2.7 HbSIP1/2/3启动子的分离、功能鉴定 | 第42-47页 |
| 2.2.7.1 启动子的分离与分析 | 第42-45页 |
| 2.2.7.2 启动子的功能分析 | 第45-47页 |
| 2.2.8 转录因子的筛选 | 第47-52页 |
| 2.2.8.1 诱饵载体的构建 | 第47-48页 |
| 2.2.8.2 诱饵载体3-AT背景浓度的筛选 | 第48-49页 |
| 2.2.8.3 胶乳cDNA文库的构建 | 第49-50页 |
| 2.2.8.4 诱饵载体筛选cDNA文库 | 第50-52页 |
| 2.2.8.5 转录因子在不同组织的表达 | 第52页 |
| 2.2.9 HbSIP1/2/3互作蛋白的筛选和鉴定 | 第52-58页 |
| 2.2.9.1 酵母双杂交诱饵载体的构建 | 第52页 |
| 2.2.9.2 酵母感受态细胞的制备 | 第52-53页 |
| 2.2.9.3 诱饵载体转化入酵母感受态细胞 | 第53页 |
| 2.2.9.4 载体自激活检测 | 第53-54页 |
| 2.2.9.5 与橡胶cDNA文库浓缩液杂交 | 第54页 |
| 2.2.9.6 阳性克隆及验证 | 第54-55页 |
| 2.2.9.7 阳性质粒的分离与鉴定 | 第55-56页 |
| 2.2.9.8 双分子荧光鉴定蛋白互作 | 第56-58页 |
| 3 结果与分析 | 第58-99页 |
| 3.1 HbSIP1/2/3的克隆和分子特性 | 第58-66页 |
| 3.1.1 HbSIP1/2/3的克隆 | 第58-60页 |
| 3.1.2 HbSIP1/2/3结构分析 | 第60-64页 |
| 3.1.3 HbSIP1/2/3蛋白特性分析 | 第64-65页 |
| 3.1.4 HbSIP1/2/3分子进化分析 | 第65-66页 |
| 3.2 HbSIP1/2/3酶学特征分析 | 第66-70页 |
| 3.2.1 HbSIP1/2/3原核表达载体构建 | 第66页 |
| 3.2.2 HbSIP1/2/3原核表达 | 第66-67页 |
| 3.2.3 HbSIP1/2/3蛋白的Western blot | 第67-68页 |
| 3.2.4 HbSIP1/2/3融合蛋白纯化 | 第68页 |
| 3.2.5 HbSIP1/2/3酶学特征 | 第68-70页 |
| 3.2.5.1 金属离子对GST-HbSIP1/2/3活性的影响 | 第68-69页 |
| 3.2.5.2 pH值对GST-HbSIP1/2/3活性的影响 | 第69页 |
| 3.2.5.3 GST-HbSIP1/2/3的酶促动力学测定 | 第69-70页 |
| 3.3 HbSIP1/2/3表达特征分析 | 第70-75页 |
| 3.3.1 HbSIP1/2/3在不同组织中的表达 | 第70-71页 |
| 3.3.2 激素处理对HbSIP1/2/3表达的影响 | 第71-72页 |
| 3.3.3 高温和低温对HbSIP1/2/3表达的影响 | 第72-74页 |
| 3.3.4 PEG和H_2O_2对HbSIP1/2/3表达的影响 | 第74-75页 |
| 3.4 HbSIP1/2/3启动子的分离和功能分析 | 第75-84页 |
| 3.4.1 HbSIP1/2/3启动子的分离 | 第75-76页 |
| 3.4.2 HbSIP1 5'UTR内含子的鉴定 | 第76-77页 |
| 3.4.3 HbSIP1/2/3的5'调控序列分析 | 第77-81页 |
| 3.4.4 HbSIP1/2/3 5'调控序列的功能验证 | 第81-84页 |
| 3.5 调控HbSIP1/2/3转录因子的筛选 | 第84-91页 |
| 3.5.1 酵母单杂诱饵载体的构建 | 第84页 |
| 3.5.2 3-AT浓度的筛选 | 第84-85页 |
| 3.5.3 胶乳ds cDNA的合成 | 第85-86页 |
| 3.5.4 酵母单杂交筛选胶乳cDNA文库及阳性克隆的筛选 | 第86-87页 |
| 3.5.5 转录因子序列分析 | 第87-91页 |
| 3.5.6 转录因子在不同组织中的表达 | 第91页 |
| 3.6 HbSIP1/2/3互作蛋白的筛选和鉴定 | 第91-99页 |
| 3.6.1 HbSIP1/2/3诱饵载体的构建 | 第91-92页 |
| 3.6.2 诱饵载体的自激活和毒性检测 | 第92-93页 |
| 3.6.3 HbSIP1/2/3互作蛋白的筛选 | 第93-97页 |
| 3.6.4 双分子荧光验证蛋白互作 | 第97-99页 |
| 3.6.4.1 分子荧光互补表达载体的构建 | 第97-98页 |
| 3.6.4.2 蛋白互作的检测 | 第98-99页 |
| 4 讨论 | 第99-107页 |
| 4.1 橡胶树HbSIP1/2/3的生化特征 | 第99-100页 |
| 4.2 HbSIP1/2/3的5'调控序列特征和功能分析 | 第100-101页 |
| 4.3 HbSIP1/2/3的表达特征 | 第101-103页 |
| 4.4 调节基因表达候选转录因子的筛选 | 第103-104页 |
| 4.5 橡胶树乳管中与HbSIP1/2/3相互作用的蛋白筛选 | 第104页 |
| 4.6 HbSIP1/2/3与橡胶生物合成 | 第104-105页 |
| 4.7 乙烯利与橡胶生物合成 | 第105-107页 |
| 5 结论 | 第107-108页 |
| 参考文献 | 第108-120页 |
| 致谢 | 第120页 |
