| 目录 | 第3-6页 |
| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-11页 |
| 第一部分 人干扰素β在毕赤酵母中的表达纯化及活性测定 | 第12-64页 |
| 前言 | 第12-27页 |
| 干扰素β的研究 | 第15-27页 |
| 1.IFN-β的基因定位及分子结构 | 第15-16页 |
| 2.IFN-β受体 | 第16-17页 |
| 3.IFN-β的生物学作用 | 第17-18页 |
| 3.1 抗病毒作用 | 第17页 |
| 3.2 抑制某些细胞的生长 | 第17页 |
| 3.3 免疫调节作用 | 第17页 |
| 3.4 抑制和杀伤肿瘤细胞 | 第17-18页 |
| 4.干扰素生物活性的作用原理 | 第18页 |
| 4.1 干扰素具有广谱性 | 第18页 |
| 4.2 干扰素有增强免疫的作用 | 第18页 |
| 4.3 干扰素还有抗纤维化的作用 | 第18页 |
| 5.IFN-β的研制 | 第18-19页 |
| 6.IFN-β的临床应用 | 第19-27页 |
| 实验内容 | 第27-60页 |
| 1.实验材料 | 第27-35页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第27页 |
| 1.2 试剂 | 第27-28页 |
| 1.3 培养基 | 第28-29页 |
| 1.4 试剂配方 | 第29-34页 |
| 1.4.1 琼脂糖凝胶电泳缓冲液TAE Buffer | 第29-30页 |
| 1.4.2 SDS碱裂解法质粒提取试剂 | 第30页 |
| 1.4.3 毕赤酵母Pichia Pastoris电转化试剂 | 第30-31页 |
| 1.4.4 SDS—PAGE溶液 | 第31-33页 |
| 1.4.5 Westen-blot试剂 | 第33页 |
| 1.4.6 蓝色琼脂糖凝胶缓冲液 | 第33-34页 |
| 1.4.7 干扰素活性检测试剂 | 第34页 |
| 1.5 引物设计 | 第34-35页 |
| 2 实验方法 | 第35-51页 |
| 2.1 重组表达载体pPIC9k-re-HuIFNβ的构建 | 第35-43页 |
| 2.1.1 构建策略 | 第36页 |
| 2.1.2 目的基因的克隆 | 第36-38页 |
| 2.1.2.1 活化菌种 | 第36页 |
| 2.1.2.2 提取质粒pLG104R | 第36-37页 |
| 2.1.2.3 PCR扩增目的基因HuIFN β | 第37页 |
| 2.1.2.4 胶回收纯化基因HuIFN β | 第37-38页 |
| 2.1.3 T载体的构建及验证 | 第38-39页 |
| 2.1.3.1 T载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.1.3.2 CaCl_2法制备大肠杆菌感受态细胞 | 第39页 |
| 2.1.3.3 大肠杆菌感受态细胞的转化 | 第39页 |
| 2.1.3.4 重组质粒的验证 | 第39页 |
| 2.1.4 突变基因的获得 | 第39-41页 |
| 2.1.4.1 实验策略 | 第39页 |
| 2.1.4.2 突变PCR引物设计 | 第39-40页 |
| 2.1.4.3 突变PCR原理 | 第40-41页 |
| 2.1.4.4 T载体的构建及验证 | 第41页 |
| 2.1.5 提取质粒pPIC9K | 第41-42页 |
| 2.1.6 双酶切载体质粒及目的基因 | 第42页 |
| 2.1.7 目的基因与载体的连接 | 第42页 |
| 2.1.8 重组质粒pPIC9k-reHuIFN β的转化和验证 | 第42-43页 |
| 2.1.8.1 重组质粒pPIC9k-reHuIFN β的转化 | 第42-43页 |
| 2.1.8.2 重组质粒的验证 | 第43页 |
| 2.2 表达菌株的构建及筛选 | 第43-46页 |
| 2.2.1 转化DNA的制备 | 第43-44页 |
| 2.2.1.1 质粒DNA的线性化 | 第43页 |
| 2.2.1.2 胶回收纯化线性化的质粒DNA | 第43-44页 |
| 2.2.2 毕赤酵母的电转化 | 第44页 |
| 2.2.2.1 电转化感受态细胞的制备 | 第44页 |
| 2.2.2.2 电转化 | 第44页 |
| 2.2.3 转化子的筛选 | 第44-46页 |
| 2.2.3.1 用Geneticin(?)抗性筛选多拷贝转化子 | 第44-45页 |
| 2.2.3.2 Mut~+和Mut~s转化子的筛选 | 第45页 |
| 2.2.3.3 PCR验证 | 第45-46页 |
| 2.2.4 重组毕赤酵母菌株的表达 | 第46页 |
| 2.3 重组蛋白的纯化 | 第46-47页 |
| 2.4 重组蛋白的Western-Blot鉴定 | 第47-48页 |
| 2.5 发酵表达目的蛋白 | 第48-49页 |
| 2.6 重组蛋白reHuIFNβ的活性检测 | 第49-51页 |
| 2.6.1 WISH细胞的培养 | 第49页 |
| 2.6.2 铺板 | 第49页 |
| 2.6.3 制备标准溶液 | 第49页 |
| 2.6.4 样品用测定培养液稀释一定倍数 | 第49页 |
| 2.6.5 96孔细胞培养板中每孔加入150 ul测定培养液 | 第49页 |
| 2.6.6 制备病毒液 | 第49页 |
| 2.6.7 攻毒 | 第49页 |
| 2.6.8 染色 | 第49页 |
| 2.6.9 比色： | 第49-50页 |
| 2.6.10 结果计算 | 第50-51页 |
| 3.结果讨论 | 第51-60页 |
| 3.1 重组表达载体pPIC9k-mHuIFN β的构建 | 第51-54页 |
| 3.1.1 目的基因HuIFNβPCR结果 | 第51页 |
| 3.1.2 目的基因测序结果 | 第51页 |
| 3.1.3 定点诱变目的基因PCR检测 | 第51-52页 |
| 3.1.4 载体目的基因双酶切电泳结果检测 | 第52-53页 |
| 3.1.5 重组质粒pPIC9K-reHuIFN β的提取 | 第53页 |
| 3.1.6 重组质粒的PCR验证 | 第53-54页 |
| 3.1.7 重组质粒测序结果分析 | 第54页 |
| 3.2 表达菌株的构建及筛选 | 第54-55页 |
| 3.2.1 重组质粒的线性化 | 第54页 |
| 3.2.2 重组毕赤酵母菌株的PCR验证 | 第54-55页 |
| 3.3 reHuIFNβ在毕赤酵母中的诱导表达纯化和鉴定 | 第55-57页 |
| 3.4 重组reHuIFNβ毕赤酵母菌株的发酵表达摸索 | 第57-60页 |
| 3.5 reHuIFN β生物活性检测 | 第60页 |
| 讨论： | 第60-64页 |
| 第二部分 人载脂蛋白ProApoA-Ⅰ在大肠杆菌系统中的表达 | 第64-85页 |
| 前言 | 第64-74页 |
| ApoA-Ⅰ的体内合成 | 第70-71页 |
| 载脂蛋白ApoA-Ⅰ在脂蛋白代谢中重要的生理功能 | 第71-74页 |
| 实验内容 | 第74-83页 |
| 1.实验材料 | 第74-75页 |
| 1.1 菌株和质粒 | 第74页 |
| 1.2 试剂 | 第74页 |
| 1.3 培养基 | 第74页 |
| 1.4 试剂配方 | 第74-75页 |
| 2.方法 | 第75-76页 |
| 2.1.引物设计 | 第75页 |
| 2.2.重组表达载体构建 | 第75-76页 |
| 2.3.人载脂蛋白ProAPOA-Ⅰ的诱导表达 | 第76页 |
| 2.4.蛋白纯化 | 第76页 |
| 2.5.蛋白浓度测定 | 第76页 |
| 2.6.ProAPOA-Ⅰ肽质量指纹图谱 | 第76页 |
| 3.结果与讨论 | 第76-83页 |
| 3.1 目的ProAPOA-Ⅰ基因的验证 | 第76-77页 |
| 3.2 重组表达载体构建 | 第77-79页 |
| 3.3 目的蛋白的表达检测及检验 | 第79-83页 |
| Ⅰ 脱盐—分子筛方法 | 第80-82页 |
| Ⅱ 脱盐—Ni—CAM一脱盐方法 | 第82-83页 |
| 讨论： | 第83-85页 |
| 参考文献 | 第85-93页 |
| 致谢 | 第93页 |
