| 摘要 | 第6-8页 |
| Abstract | 第8-10页 |
| 缩略词 | 第16-18页 |
| 第一章 绪论 | 第18-31页 |
| 1.1 酸性土壤与铝毒 | 第18页 |
| 1.2 钙调素的结构 | 第18-19页 |
| 1.3 钙/钙调素信号途径在胁迫中的作用研究进展 | 第19-23页 |
| 1.3.1 干旱胁迫 | 第20-21页 |
| 1.3.2 冷胁迫 | 第21页 |
| 1.3.3 盐胁迫 | 第21-22页 |
| 1.3.4 热胁迫 | 第22页 |
| 1.3.5 铝胁迫 | 第22-23页 |
| 1.4 钙调磷酸酶在微生物中的作用研究进展 | 第23-30页 |
| 1.4.1 丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族简介 | 第23-24页 |
| 1.4.2 钙调磷酸酶的结构 | 第24-25页 |
| 1.4.3 钙调蛋白磷酸酶的活性调节 | 第25-26页 |
| 1.4.3.1 调节亚基的调节 | 第25页 |
| 1.4.3.2 CaM的调节 | 第25-26页 |
| 1.4.3.3 小分子抑制剂的调节 | 第26页 |
| 1.4.4 钙调磷酸酶的效应蛋白 | 第26-29页 |
| 1.4.4.1 Crzl的主要功能 | 第27页 |
| 1.4.4.2 Crzl活性和定位的调控 | 第27-28页 |
| 1.4.4.3 Crzl的磷酸化 | 第28-29页 |
| 1.4.5 钙调磷酸酶在微生物中的功能 | 第29-30页 |
| 1.5 本研究的目的意义及内容 | 第30-31页 |
| 第二章 原核表达载体的构建以及CaM-GST融合蛋白多克隆抗体制备 | 第31-42页 |
| 2.1 材料与方法 | 第31-38页 |
| 2.1.1 研究材料与培养基 | 第31-32页 |
| 2.1.2 菌株与载体 | 第32页 |
| 2.1.3 酶与试剂 | 第32页 |
| 2.1.4 抗生素或抑制剂的配制 | 第32页 |
| 2.1.5 酵母总RNA的提取及cDNA合成 | 第32-33页 |
| 2.1.6 CaM基因的TA克隆 | 第33-34页 |
| 2.1.7 CaM基因原核表达载体的构建及诱导表达 | 第34-35页 |
| 2.1.8 亲和层析分离纯化目的蛋白的方法 | 第35-37页 |
| 2.1.9 制备钙调素和钙调磷酸酶催化亚基的多抗 | 第37-38页 |
| 2.2 结果与分析 | 第38-41页 |
| 2.2.1 CaM基因原核表达载体的构建 | 第38-39页 |
| 2.2.2 CaM重组蛋白的表达及纯化 | 第39-40页 |
| 2.2.3 CaM和CNA抗体效价的检测 | 第40-41页 |
| 2.3 讨论 | 第41-42页 |
| 第三章 铝胁迫下土生隐球酵母钙调素与钙调磷酸酶的表达与互作及表达水平 | 第42-51页 |
| 3.1 材料与方法 | 第42-44页 |
| 3.1.1 菌种和培养基 | 第42页 |
| 3.1.2 抑制剂处理下土生隐球酵母菌株生长曲线的测定 | 第42页 |
| 3.1.3 添加抑制剂时上生隐球酵母耐铝能力检测 | 第42-43页 |
| 3.1.4 总RNA提取及RT-PCR分析 | 第43页 |
| 3.1.5 蛋白质提取及Western blotting分析 | 第43页 |
| 3.1.6 GST融合蛋白pull-down分析 | 第43-44页 |
| 3.2 结果与分析 | 第44-48页 |
| 3.2.1 钙调素信号途径组分抑制剂对土生隐球酵母生长的影响 | 第44-45页 |
| 3.2.2 钙调素信号途径组分抑制剂处理下土生隐球酵母耐铝性能检测 | 第45-46页 |
| 3.2.3 铝胁迫下CaM和CNA的基因表达水平分析 | 第46-47页 |
| 3.2.4 体外验证CaM和CNA的相互作用 | 第47-48页 |
| 3.2.5 铝胁迫对CaM和CNA相互作用的影响 | 第48页 |
| 3.3 讨论 | 第48-51页 |
| 3.3.1 抑制剂对土生隐球酵母生长的影响 | 第48-49页 |
| 3.3.2 铝胁迫对CaM和CaN表达与互作的影响 | 第49-51页 |
| 第四章 转基因酵母的耐铝作用分析 | 第51-66页 |
| 4.1 材料与方法 | 第51-53页 |
| 4.1.1 菌株及载体 | 第51页 |
| 4.1.2 酶和试剂 | 第51页 |
| 4.1.3 钙调磷酸酶催化亚基(CNA)酵母表达载体的构建 | 第51-52页 |
| 4.1.4 酿酒酵母感受态细胞的制备 | 第52-53页 |
| 4.1.5 转基因酵母检测 | 第53页 |
| 4.1.6 转基因酵母耐铝能力检测 | 第53页 |
| 4.1.7 培养基中剩余活性铝含量测定 | 第53页 |
| 4.1.8 转基因酵母生长曲线的测定 | 第53页 |
| 4.2 结果与分析 | 第53-62页 |
| 4.2.1 CaM基因和CNA基因酵母表达载体的构建 | 第53-57页 |
| 4.2.1.1 土生隐球酵母CNA基因的克隆 | 第53-56页 |
| 4.2.1.2 土生隐球酵母CaM和CNA基因酵母表达载体构建 | 第56-57页 |
| 4.2.2 pYES3/CT-CNA和pYES3/CT-CaM转基因酵母的鉴定 | 第57-58页 |
| 4.2.3 检测pYES3/CT-CNA和pYES3/CT-CaM转基因酵母耐铝能力 | 第58页 |
| 4.2.4 转基因酵母吸收铝的能力检测 | 第58-59页 |
| 4.2.5 pYES3/CT-CNA和pYES3/CT-CaM转基因酵母的生长曲线 | 第59-62页 |
| 4.3 讨论 | 第62-66页 |
| 4.3.1 转基因酵母耐铝能力变化 | 第62-63页 |
| 4.3.2 过量表达土生隐球酵母CAN和CaM基因的转基因酵母吸收铝的影响 | 第63-66页 |
| 第五章 铝胁迫下丹波黑大豆钙调素与钙调磷酸酶的表达与互作 | 第66-71页 |
| 5.1 材料与方法 | 第66-68页 |
| 5.1.1 植物材料 | 第66页 |
| 5.1.2 丹波黑大豆的培养 | 第66页 |
| 5.1.3 不同浓度铝处理大豆根尖细胞 | 第66-67页 |
| 5.1.4 根尖总RNA的提取及RT-PCR分析 | 第67页 |
| 5.1.5 根尖总蛋白的提取,Western blotting分析 | 第67页 |
| 5.1.6 GST融合蛋白pull-down分析 | 第67-68页 |
| 5.2 结果与分析 | 第68-69页 |
| 5.2.1 铝胁迫下丹波黑大豆钙调素基因和蛋白水平表达的分析 | 第68-69页 |
| 5.2.2 铝胁迫下丹波黑大豆钙调素与钙调磷酸酶互作分析 | 第69页 |
| 5.3 讨论 | 第69-71页 |
| 第六章 总结和展望 | 第71-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-86页 |
| 附录A 攻读硕士期间发表的文章 | 第86页 |
