| 摘要 | 第5-7页 |
| ABSTRACT | 第7-8页 |
| 第1章 人源蛋白质ARAP3选择性识别RHOA的结构基础 | 第13-57页 |
| 1.1 背景介绍 | 第13-26页 |
| 1.1.1 引言 | 第13页 |
| 1.1.2 小GTP酶 | 第13-14页 |
| 1.1.3 Rho家族小GTP酶 | 第14-15页 |
| 1.1.4 Rho家族小GTP酶的调控蛋白质 | 第15-17页 |
| 1.1.5 RhoA的生物学功能 | 第17页 |
| 1.1.6 Arf6的生物功能 | 第17-18页 |
| 1.1.7 ARAP3是多结构域蛋白质 | 第18页 |
| 1.1.8 ARAP3的ArfGAP结构域活性的调节 | 第18-19页 |
| 1.1.9 ARAP3的RhoGAP结构域活性的调节 | 第19-20页 |
| 1.1.10 ARAP3的生物功能 | 第20-23页 |
| 参考文献 | 第23-26页 |
| 1.2 材料方法 | 第26-41页 |
| 1.2.1 蛋白质边界的选择 | 第26页 |
| 1.2.2 目的基因片段的扩增 | 第26-27页 |
| 1.2.3 目的基因片段的回收 | 第27-28页 |
| 1.2.4 质粒和目的基因的双酶切 | 第28页 |
| 1.2.5 目的基因片段克隆到质粒 | 第28-29页 |
| 1.2.6 大肠杆菌化学转化感受态细胞Gold的制备 | 第29页 |
| 1.2.7 连接产物转化至大肠杆菌感受态 | 第29-30页 |
| 1.2.8 测序及菌种的保存 | 第30页 |
| 1.2.9 质粒的突变 | 第30-31页 |
| 1.2.10 RhoA、Cdc42以及Rac1的克隆 | 第31页 |
| 1.2.11 ARAP3-RhoGAP-RhoA (2-181,F25N)融合蛋白质的克隆 | 第31-32页 |
| 1.2.12 ARAP3的RhoGAP结构域的表达与纯化 | 第32-33页 |
| 1.2.12.1 带有His-tag的目的蛋白质的Ni柱亲和纯化 | 第32-33页 |
| 1.2.12.2 凝胶过滤柱层析(分子筛)进一步纯化目的蛋白质 | 第33页 |
| 1.2.12.3 蛋白质的浓缩及更换缓冲液 | 第33页 |
| 1.2.13 人源RhoA、Cdc42以及Rac1的表达和纯化 | 第33页 |
| 1.2.14 ARAP3-RhoGAP-RhoA (2-181,F25N)融合蛋白质的表达与纯化 | 第33页 |
| 1.2.15 晶体筛选优化 | 第33-34页 |
| 1.2.16 蛋白质晶体的X-射线衍射数据的收集 | 第34-35页 |
| 1.2.16.1 蛋白质晶体防冻保护剂 | 第34页 |
| 1.2.16.2 对中晶体 | 第34页 |
| 1.2.16.3 调整像板距离 | 第34页 |
| 1.2.16.4 合适的光强 | 第34-35页 |
| 1.2.16.5 选择合适的摆角 | 第35页 |
| 1.2.16.6 选择合适的收集角度 | 第35页 |
| 1.2.17 数据处理和结构解析 | 第35页 |
| 1.2.18 等温滴定量热(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)实验 | 第35-37页 |
| 1.2.19 酶活力实验 | 第37-39页 |
| 参考文献 | 第39-41页 |
| 1.3 实验结果 | 第41-51页 |
| 1.3.1 引言 | 第41页 |
| 1.3.2 ARAP3的RhoGAP结构域的单体结构 | 第41-43页 |
| 1.3.3 ARAP3的RhoGAP结构域与RhoA的过渡态复合物结构 | 第43-45页 |
| 1.3.4 ARAP3的RhoGAP结构域与RhoA的相互作用界面 | 第45-47页 |
| 1.3.5 ARAP3-RhoGAP-RhoA过渡态复合物结构与其他RhoGAP·RhoA过渡态复合物结构的比较 | 第47-50页 |
| 1.3.6 ARAP3选择性识别RhoA的结构生物学机制 | 第50-51页 |
| 1.4 讨论 | 第51-57页 |
| 参考文献 | 第55-57页 |
| 第2章 拟南芥蛋白质APUM23特异性识别18S核糖体RNA的结构基础 | 第57-107页 |
| 2.1 背景 | 第57-74页 |
| 2.1.1 PUF蛋白质的功能 | 第57-61页 |
| 2.1.1.1 PUF蛋白质抑制mRNA的表达 | 第57-58页 |
| 2.1.1.2 PUF蛋白质激活mRNA的翻译 | 第58-59页 |
| 2.1.1.3 PUF蛋白质调节mRNA的定位 | 第59-60页 |
| 2.1.1.4 核仁定位的PUF蛋白质调节前核糖体RNA加工 | 第60-61页 |
| 2.1.2 PUF蛋白质的结构 | 第61-62页 |
| 2.1.3 PUF蛋白质对特异性RNA序列的模块化识别 | 第62-63页 |
| 2.1.4 PUF蛋白质的应用 | 第63-65页 |
| 2.1.5 APUM23的功能 | 第65-69页 |
| 参考文献 | 第69-74页 |
| 2.2 材料和方法 | 第74-82页 |
| 2.2.1 APUM23的Puf-repeat串联结构域的克隆 | 第74-76页 |
| 2.2.1.1 蛋白质边界的选择 | 第74页 |
| 2.2.1.2 目的基因片段的扩增 | 第74-75页 |
| 2.2.1.3 表达质粒的克隆 | 第75页 |
| 2.2.1.4 点突变体及片段删除型突变体的构建 | 第75-76页 |
| 2.2.2 APUM23的Puf-repeat串联结构域的表达与纯化 | 第76-79页 |
| 2.2.2.1 LB培养基和LR培养基配方 | 第76页 |
| 2.2.2.2 硒代甲硫氨酸标记的蛋白质(Se-Met-APUM23~(85-655))的表达 | 第76-77页 |
| 2.2.2.3 APUM23的Puf-repeat串联结构域的表达 | 第77页 |
| 2.2.2.4 APUM23的Puf-repeat串联结构域的纯化 | 第77-79页 |
| 2.2.3 RNA母液的制备 | 第79页 |
| 2.2.4 APUM23的Puf-repeat串联结构域与RNA的复合物晶体的生长 | 第79-80页 |
| 2.2.5 APUM23的Puf-repeat串联结构域与RNA的复合物晶体的X-射线衍射数据的收集 | 第80页 |
| 2.2.6 APUM23的Puf-repeat串联结构域与RNA的复合物晶体的X-射线衍射数据处理与结构解析 | 第80-81页 |
| 2.2.7 等温滴定量热(Isothermal Titration Calorimetry, ITC)实验 | 第81页 |
| 参考文献 | 第81-82页 |
| 2.3 实验结果 | 第82-98页 |
| 2.3.1 APUM23与10个核苷酸的RNA5'-GAAUUGACGG-3'的复合物晶体结构 | 第82-84页 |
| 2.3.2 APUM23与11个核苷酸的RNA5'-GGAAUUGACGG-3'的复合物晶体结构 | 第84页 |
| 2.3.3 APUM23对A_(+2)和A_(+7)的特异性模块化识别 | 第84-88页 |
| 2.3.4 APUM23对G_0、G_(+1)、G_(+6)、G_(+9)和G_(+10)的特异性模块化识别 | 第88页 |
| 2.3.5 APUM23对C_(+8)的特异性模块化识别 | 第88-89页 |
| 2.3.6 APUM23对A_(+3)的识别 | 第89页 |
| 2.3.7 APUM23对U_(+4)和U_(+5)的识别 | 第89-92页 |
| 2.3.8 APUM23以及Nop9和相同RNA5'-GGAAUUGACGG-3'复合物晶体结构的比较 | 第92-94页 |
| 2.3.9 APUM23的R3 Puf repeat结构域的插入氨基酸序列阻碍了G_0和A_(+3)碱基之间的堆积 | 第94-98页 |
| 2.4 讨论 | 第98-107页 |
| 2.4.1 APUM23是新型结构的PUF蛋白质 | 第98-99页 |
| 2.4.2 APUM23和Nop9家族蛋白质的R3 Puf repeat结构域都存在比较保守插入氨基酸序列 | 第99-100页 |
| 2.4.3 APUM23调控前核糖体RNA加工的可能分子机制 | 第100-103页 |
| 2.4.4 APUM23潜在的应用前景 | 第103-104页 |
| 2.4.5 不足之处 | 第104页 |
| 参考文献 | 第104-107页 |
| 致谢 | 第107-108页 |
| 在读期间发表的学术论文和取得的研究成果 | 第108页 |
