| 本论文的主要创新点 | 第5-9页 |
| 摘要 | 第9-11页 |
| Abstract | 第11-12页 |
| 第一章 绪论 | 第13-39页 |
| 1. 剪接(Splicing) | 第13-18页 |
| 1.1 保守的剪接序列(Consensus splicing signals) | 第13-16页 |
| 1.2 剪接体(Spliceosome) | 第16-18页 |
| 2. 可变剪接(Alternative splicing) | 第18-32页 |
| 2.1 可变剪接模式(Alternative splicing modes) | 第19页 |
| 2.2 可变剪接调控机制(Alternative splicing mechanism) | 第19-32页 |
| 2.2.1 调控元件和调控蛋白(Regulatory elements and proteins) | 第21-25页 |
| 2.2.2 位置效应对剪接的调控(Position-dependent splicing regulation) | 第25-26页 |
| 2.2.3 RNA二级结构对可变剪接的调控 | 第26-27页 |
| 2.2.4 RNA聚合酶Ⅱ转录速率对可变剪接的调控 | 第27-30页 |
| 2.2.5 表观遗传修饰对可变剪接的调控 | 第30-32页 |
| 3. 剪接异常与疾病的关系 | 第32-35页 |
| 4. U2AF65和U2AF35蛋白简介 | 第35-37页 |
| 5. 课题研究内容及研究意义 | 第37-39页 |
| 第二章 实验材料和方法 | 第39-86页 |
| 1 实验材料 | 第39-58页 |
| 1.1 细胞株和菌株 | 第39页 |
| 1.2 质粒 | 第39页 |
| 1.3 常用生化试剂 | 第39-40页 |
| 1.4 细胞培养相关试剂 | 第40-41页 |
| 1.4.1 细胞培养试剂 | 第40页 |
| 1.4.2 细胞转染试剂 | 第40-41页 |
| 1.5 工具酶 | 第41-42页 |
| 1.5.1 限制性内切酶 | 第41页 |
| 1.5.2 核酸酶 | 第41页 |
| 1.5.3 连接酶 | 第41页 |
| 1.5.4 DNA聚合酶 | 第41-42页 |
| 1.5.5 逆转录酶 | 第42页 |
| 1.6 试剂盒 | 第42页 |
| 1.7 实验仪器 | 第42-43页 |
| 1.8 化学合成RNA Oligos | 第43页 |
| 1.9 化学合成的DNA Oligos | 第43-48页 |
| 1.10 抗体 | 第48-49页 |
| 1.11 图像文字处理等相关软件 | 第49页 |
| 1.12 网络数据库资源 | 第49页 |
| 1.13 溶液配制 | 第49-58页 |
| 1.13.1 碱裂解法抽提质粒溶液配制 | 第49-50页 |
| 1.13.2 大肠杆菌感受态制备溶液配制 | 第50页 |
| 1.13.3 细菌用抗生素溶液及培养基配制 | 第50-51页 |
| 1.13.4 细胞用抗生素溶液及培养基配制 | 第51-52页 |
| 1.13.5 琼脂糖凝胶电泳溶液配制 | 第52-53页 |
| 1.13.6 SDS-PAGE凝胶电泳溶液配制 | 第53-54页 |
| 1.13.7 蛋白质免疫印迹杂交溶液配制 | 第54页 |
| 1.13.8 免疫共沉淀溶液配制 | 第54-55页 |
| 1.13.9 CLIP-seq溶液配制 | 第55-58页 |
| 2 实验技术与方法 | 第58-86页 |
| 2.1 碱裂解法抽提质粒 | 第58页 |
| 2.2 超纯质粒抽提 | 第58-59页 |
| 2.3 制备大肠杆菌感受态细胞 | 第59页 |
| 2.4 普通克隆构建 | 第59-61页 |
| 2.4.1 逆转录获取全长 CDS | 第59-60页 |
| 2.4.2 PCR扩增目的片段 | 第60-61页 |
| 2.5 点突变和删除突变克隆构建 | 第61-62页 |
| 2.5.1 突变引物的设计原则 | 第61页 |
| 2.5.2 DpnI消解模板质粒 | 第61-62页 |
| 2.6 细胞培养技术 | 第62-63页 |
| 2.6.1 细胞复苏 | 第62页 |
| 2.6.2 细胞传代 | 第62-63页 |
| 2.6.3 细胞冻存 | 第63页 |
| 2.7 细胞转染方法 | 第63-65页 |
| 2.7.1 转染siRNA | 第63-64页 |
| 2.7.2 转染质粒 | 第64页 |
| 2.7.3 质粒和siRNA共转染 | 第64-65页 |
| 2.8 Trizol抽提细胞总RNA | 第65-66页 |
| 2.9 Trizol抽提细胞总蛋白 | 第66页 |
| 2.10 RT-PCR | 第66-67页 |
| 2.11 免疫印迹杂交Western Blot | 第67-69页 |
| 2.12 免疫沉淀Immunoprecipitation | 第69-70页 |
| 2.13 CLIP-seq实验方法 | 第70-83页 |
| 2.13.1 UV交联细胞 | 第71页 |
| 2.13.2 裂解细胞 | 第71页 |
| 2.13.3 准备磁珠 | 第71-72页 |
| 2.13.4 抗体抗原捕获 | 第72页 |
| 2.13.5 片段化RNA tags | 第72-73页 |
| 2.13.6 PNK末端标记 | 第73-74页 |
| 2.13.7 连接5’-RNA Linker | 第74-75页 |
| 2.13.8 Fast AP去除3’端的磷酸丛团 | 第75页 |
| 2.13.9 电泳及转膜 | 第75-76页 |
| 2.13.10 抽提NC/膜上附着的RNA | 第76-77页 |
| 2.13.11 连接3’-RNA Linker | 第77-78页 |
| 2.13.12 消解丛因组DNA | 第78页 |
| 2.13.13 无水乙醇沉淀RNA | 第78页 |
| 2.13.14 SuperScriptⅢ逆转录 | 第78-79页 |
| 2.13.15 Phusion DNA Polymerase PCR反应 | 第79-80页 |
| 2.13.16 胶回收PCR产物 | 第80页 |
| 2.13.17 第二轮Bar-Coded PCR | 第80-81页 |
| 2.13.18 胶回收第二轮PCR产物 | 第81页 |
| 2.13.19 TA克隆测序预检测文库质量 | 第81-82页 |
| 2.13.20 菌落PCR鉴定阳性克隆 | 第82-83页 |
| 2.14 RASL-seq实验方法 | 第83-85页 |
| 2.14.1 退火处理(Annealing) | 第83页 |
| 2.14.2 筛选处理(Selection) | 第83页 |
| 2.14.3 连接反应(Ligation) | 第83-84页 |
| 2.14.4 PCR扩增构建bar-coded文库 | 第84页 |
| 2.14.5 文库质量预检测和后期处理 | 第84-85页 |
| 2.15 RNA-seq实验方法 | 第85-86页 |
| 第三章 实验结果与讨论 | 第86-115页 |
| 第一部分 对U2AF 3’剪接位点识别和可变剪接调控机制的研究 | 第86-107页 |
| 实验结果 | 第86-105页 |
| 1. 全基因组范围内鉴定U2AF-RNA的结合图谱 | 第86-89页 |
| 2. U2AF识别人类基因组内88%的功能性3’剪接位点 | 第89-92页 |
| 3. U2AF65结合在除3’剪接位点以外的其它位置 | 第92-93页 |
| 4. U2AF在调控基因表达和可变剪接方面的重要功能 | 第93-96页 |
| 5. U2AF通过多种机制调控可变剪接 | 第96-99页 |
| 6. U2AF65在内含子内的结合对下游3’剪接位点识别产生极性效应 | 第99-100页 |
| 7. U2AF65和U2AF35协同调控可变剪接 | 第100-102页 |
| 8. MDS相关的U2AF35突变诱发可变剪接缺陷 | 第102-105页 |
| 讨论 | 第105-107页 |
| 第二部分：PRP19作为E3 ligase调控底物U2AF35蛋白水平的表达 | 第107-115页 |
| 实验结果 | 第107-113页 |
| 1. RNAi U2AF65会下调U2AF35蛋白水平 | 第107-108页 |
| 2. 调控不发生在RNA水平层面 | 第108-109页 |
| 3. U2AF35蛋白水平不依赖于microRNA通路的调控 | 第109-110页 |
| 4. U2AF35蛋白可作为蛋白酶体的识别底物而降解 | 第110-111页 |
| 5. PRP19调控U2AF35蛋白表达水平 | 第111-113页 |
| 讨论 | 第113-115页 |
| 参考文献 | 第115-124页 |
| 攻博期间发表的科研成果 | 第124-125页 |
| 致谢 | 第125页 |
