| 摘要 | 第7-9页 |
| Abstract | 第9-10页 |
| 缩略语(Abbreviations) | 第11-13页 |
| 第一章 前言 | 第13-22页 |
| 1 微生物活性天然产物生物合成的研究 | 第13-16页 |
| 1.1 聚酮类化合物的生物合成 | 第13-14页 |
| 1.2 非核糖体多肽类物质的生物合成 | 第14-15页 |
| 1.3 杂合NRPS/PKS类物质的生物合成 | 第15-16页 |
| 1.4 "非天然"的活性天然产物 | 第16页 |
| 2 天然产物的筛选策略 | 第16-17页 |
| 3 利用基因组学分析发掘新的天然产物 | 第17-18页 |
| 4 链霉菌次生代谢调控系统 | 第18-20页 |
| 4.1 链霉菌全局性调控的研究 | 第18-19页 |
| 4.2 链霉菌途径特异性调控的研究 | 第19-20页 |
| 5 本研究的目的和意义 | 第20-22页 |
| 第二章 材料与方法 | 第22-39页 |
| 1 实验材料 | 第22-31页 |
| 1.1 实验所用的菌株和质粒 | 第22-24页 |
| 1.2 实验用引物 | 第24-26页 |
| 1.3 培养基 | 第26-28页 |
| 1.4 主要生化试剂 | 第28-31页 |
| 2 实验方法 | 第31-39页 |
| 2.1 分子生物学基本操作 | 第31页 |
| 2.2 His标签蛋白的诱导表达及纯化 | 第31-32页 |
| 2.3 凝胶阻滞迁移分析(EMSA) | 第32页 |
| 2.4 链霉菌培养及菌种保藏 | 第32-33页 |
| 2.5 链霉菌基因组总DNA的提取 | 第33页 |
| 2.6 链霉菌生物活性测定 | 第33-34页 |
| 2.7 链霉菌抗性背景测定 | 第34页 |
| 2.8 大肠杆菌-链霉菌属间接合转移 | 第34页 |
| 2.9 高通量接合转移 | 第34-35页 |
| 2.10 高通量接合转移平板的生物活性测定 | 第35页 |
| 2.11 原生质体的制备及转化 | 第35页 |
| 2.12 链霉菌菌丝体电转化 | 第35-36页 |
| 2.13 新鲜预萌发孢子电转化 | 第36页 |
| 2.14 链霉菌RNA的抽提 | 第36页 |
| 2.15 RNA逆转录反应 | 第36-37页 |
| 2.16 链霉菌发酵萃取和HPLC检测 | 第37页 |
| 2.17 荧光显微镜观测EGFP | 第37页 |
| 2.18 利用EGFP报告系统检测基因的表达情况 | 第37-38页 |
| 2.19 生物信息学分析工具 | 第38-39页 |
| 第三章 链霉菌SH-62遗传操作系统的初步探索 | 第39-43页 |
| 1 前言 | 第39页 |
| 2 结果与分析 | 第39-43页 |
| 2.1 链霉菌SH-62抗性背景测定 | 第39-40页 |
| 2.2 链霉菌SH-62接合转移条件摸索 | 第40-41页 |
| 2.3 链霉菌SH-62原生质体制备及转化 | 第41-42页 |
| 2.4 链霉菌SH-62电转化 | 第42-43页 |
| 2.4.1 链霉菌菌丝体电转化 | 第42页 |
| 2.4.2 链霉菌预萌发孢子电转化 | 第42-43页 |
| 第四章 链霉菌SH-62中NRPS/PKS类活性天然产物生物合成基因簇的发掘 | 第43-49页 |
| 1 前言 | 第43页 |
| 2 结果与分析 | 第43-48页 |
| 2.1 链霉菌SH-62基因组的生物信息学分析 | 第43-44页 |
| 2.2 链霉菌SH-62 BAC文库的PCR筛选 | 第44页 |
| 2.3 利用高通量接合转移对阳性克隆子进行异源表达 | 第44-48页 |
| 2.3.1 阳性克隆的高通量接合转移 | 第46页 |
| 2.3.2 接合子的表型观察及生物活性测定 | 第46-48页 |
| 3 讨论 | 第48-49页 |
| 第五章 链霉菌SH-62中雷纳霉素类似物基因簇(lem)的克隆及异源表达 | 第49-59页 |
| 1 前言 | 第49-50页 |
| 2 结果与分析 | 第50-58页 |
| 2.1 lem基因簇的克隆 | 第50页 |
| 2.2 阳性BAC的重叠性分析 | 第50页 |
| 2.3 lem基因簇的生物信息学分析 | 第50-52页 |
| 2.4 lem基因簇与lnm基因簇的比较分析 | 第52-53页 |
| 2.5 基因簇中杂合NRPS/PKS合酶的比较分析 | 第53页 |
| 2.6 lem基因簇的异源表达 | 第53-58页 |
| 2.6.1 以S.lividans为宿主的异源表达 | 第53-54页 |
| 2.6.2 以S.albus为宿主的异源表达 | 第54-57页 |
| 2.6.3 以S.sahachiroi为宿主的异源表达 | 第57-58页 |
| 3 讨论 | 第58-59页 |
| 第六章 Azinomycin B生物合成调控机制的初步研究 | 第59-70页 |
| 1 前言 | 第59页 |
| 2 结果与分析 | 第59-68页 |
| 2.1 AzinomycinB生物合成基因簇中启动子的克隆及活性检测 | 第59-61页 |
| 2.1.1 利用启动子探针载体plJ8660对启动子片段进行克隆 | 第59-61页 |
| 2.1.2 启动子活性的检测 | 第61页 |
| 2.2 Orf7和Orf9的超量表达 | 第61-62页 |
| 2.2.1 表达载体的构建 | 第61页 |
| 2.2.2 Orf7和Orf9的表达和纯化 | 第61-62页 |
| 2.3 凝胶阻滞迁移实验(EMSA)鉴定蛋白与启动子的互作 | 第62-64页 |
| 2.4 orf7和orf9与azinomycin B生物合成相关性的研究 | 第64-67页 |
| 2.4.1 orf7和orf9同框缺失突变菌株的验证 | 第64页 |
| 2.4.2 Orf7和Orf9超量表达菌株的构建 | 第64-66页 |
| 2.4.3 突变菌株的发酵产物分析 | 第66-67页 |
| 2.5 RT-PCR检测同框缺失突变菌株中azinomycin B结构基因转录水平的变化 | 第67页 |
| 2.6 通过检测启动子的活性预测基因的表达 | 第67-68页 |
| 2.6.1 S.sahachiroi中启动子活性的检测 | 第68页 |
| 2.6.2 S.lividans ZX1中启动子活性的检测 | 第68页 |
| 3 讨论 | 第68-70页 |
| 第七章 总结和展望 | 第70-72页 |
| 1 总结 | 第70页 |
| 2 展望 | 第70-72页 |
| 附录 | 第72-82页 |
| 参考文献 | 第82-87页 |
| 致谢 | 第87页 |
