| 摘要 | 第6-9页 |
| ABSTRACT | 第9-12页 |
| 缩略词 | 第18-19页 |
| 第一章 绪论 | 第19-39页 |
| 1.1 端粒与衰老、肿瘤 | 第19-21页 |
| 1.1.1 端粒 | 第19-20页 |
| 1.1.2 ALT肿瘤 | 第20-21页 |
| 1.2 DNA甲基化 | 第21-25页 |
| 1.2.1 DNA去甲基化机制 | 第22-23页 |
| 1.2.2 DNA甲基化与组蛋白修饰 | 第23-25页 |
| 1.3 DNMTs在转录水平的调控 | 第25-27页 |
| 1.3.1 RB介导的DNMTs基因的转录调控 | 第26页 |
| 1.3.2 FOXO3a介导的DNMTs转录调控 | 第26-27页 |
| 1.3.3 MDM2与DNMTs的转录调节 | 第27页 |
| 1.4 DNMT1的翻译后修饰 | 第27-29页 |
| 1.4.1 DNMT1的乙酰化和泛素化修饰 | 第27-28页 |
| 1.4.2 DNMT1的磷酸化和甲基化修饰 | 第28-29页 |
| 1.5 DNA甲基化酶基因突变与疾病 | 第29页 |
| 1.6 非编码RNA | 第29-31页 |
| 1.6.1 miRNAs简介 | 第30-31页 |
| 1.6.2 miRNAs与DNA甲基化 | 第31页 |
| 1.7 p21 | 第31-34页 |
| 1.7.1 p21调控机制 | 第32-34页 |
| 1.8 p16~(INK4a) | 第34-36页 |
| 1.8.1 PcG蛋白对p16~(INK4a)的调控 | 第34-35页 |
| 1.8.2 p16~(INK4a)的转录调控 | 第35-36页 |
| 1.9 前期结果 | 第36-38页 |
| 1.10 技术路线 | 第38-39页 |
| 第二章 材料与方法 | 第39-61页 |
| 2.1 实验仪器材料 | 第39-41页 |
| 2.1.1 实验试剂及耗材 | 第39页 |
| 2.1.2 实验仪器 | 第39-41页 |
| 2.2 细胞培养方法 | 第41-45页 |
| 2.2.1 细胞培养相关试剂配制 | 第41-43页 |
| 2.2.2 细胞复苏 | 第43页 |
| 2.2.3 细胞的传代 | 第43-44页 |
| 2.2.4 细胞冻存 | 第44-45页 |
| 2.3 Western Blot | 第45-49页 |
| 2.3.1 蛋白提取以及浓度测定 | 第45-46页 |
| 2.3.2 SDS-PAGE电泳 | 第46-48页 |
| 2.3.3 转膜 | 第48-49页 |
| 2.3.4 免疫杂交与显色 | 第49页 |
| 2.3.5 本实验使用的一抗及稀释倍数 | 第49页 |
| 2.4 实时荧光定量PCR | 第49-52页 |
| 2.4.1 Trizol法提取细胞的总RNA | 第49-50页 |
| 2.4.2 逆转录 | 第50页 |
| 2.4.3 RT-qPCR | 第50-52页 |
| 2.5 无内毒素质粒提取 | 第52-53页 |
| 2.6 质粒转染 | 第53页 |
| 2.7 miRNA检测 | 第53-55页 |
| 2.7.1 目标miRNA引物设计 | 第54-55页 |
| 2.7.2 miRNA检测 | 第55页 |
| 2.8 细胞基因组DNA的提取 | 第55页 |
| 2.9 p16的甲基化水平检测 | 第55-59页 |
| 2.9.1 硫化测序PCR (Bisulfate sequencing PCR,BSP)技术 | 第55-56页 |
| 2.9.2 利用DNA甲基化修饰试剂盒 EZ DNA Methylation-Gold kit(ZYMO Research)进行处理检测。 | 第56-57页 |
| 2.9.3 BSP-PCR扩增 | 第57-58页 |
| 2.9.4 TA克隆 | 第58-59页 |
| 2.10 流式细胞术检测细胞周期 | 第59-61页 |
| 第三章 实验结果 | 第61-78页 |
| 3.1 在ALT肿瘤细胞395-9B-1中过表达外源p21诱导p16在mRNA水平的表达升高 | 第61-65页 |
| 3.1.1 在395-9B-1细胞中转染外源p21-GFP-pcDNA3.1过表达载体引起p16在mRNA水平表达升高 | 第61-63页 |
| 3.1.2 395-9B-1、395-3B-2细胞转染p21+PQCXIP过表达载体后细胞衰老死亡 | 第63-64页 |
| 3.1.3 395-9B-1、395-3B-2中过表达p21后,p21可能通过转录因子Sp1、E2F1降低Dnmt1的表达 | 第64-65页 |
| 3.2 转染试剂lipo2000影响395-9B-1细胞中Dnmt1的表达 | 第65-67页 |
| 3.3 Lipofectamine2000处理影响Hela细胞中DNMT1的表达 | 第67-71页 |
| 3.3.1 Lipo fectamine2000处理影响HeLa细胞的状态 | 第67-68页 |
| 3.3.2 Lipo fectamine2000处理影响HeLa细胞中DNMT1的表达 | 第68-69页 |
| 3.3.3 不同浓度的Lipo fectamine2000对Hela细胞中DNMT1表达的影响 | 第69-71页 |
| 3.4 395-9B-1细胞中转染miR-185、miR-152 mimics,Dnmt1的表达下调,p16表达升高,p21表达升高 | 第71-72页 |
| 3.5 395-9B-1细胞中重复转染miR-185、miR-152,引起p16的表达升高,组蛋白修饰改变以及细胞周期运行加快 | 第72-78页 |
| 3.5.1 395-9B-1细胞中共转染miR- 185、miR-152,诱导p16蛋白表达持续升高 | 第72-74页 |
| 3.5.2 共转染miR-185、miR-152可能通过抑制H3K27me3,促进p16的表达 | 第74-75页 |
| 3.5.3 395-9B-1细胞中过表达miR-152、 miR-185 mimics 2天时细胞周期增快 | 第75-78页 |
| 第四章 总结与讨论 | 第78-82页 |
| 4.1 总结 | 第78-79页 |
| 4.2 讨论 | 第79-82页 |
| 致谢 | 第82-83页 |
| 参考文献 | 第83-94页 |
| 附录A 研究生期间发表论文 | 第94页 |
