| 摘要 | 第1-7页 |
| ABSTRACT | 第7-13页 |
| 引言 | 第13-18页 |
| 1 鱼类性别决定和性腺分化 | 第13-14页 |
| 2 牙鲆性腺分化及性别决定 | 第14-15页 |
| 3 microRNA简介 | 第15-17页 |
| 4 研究目的和意义 | 第17-18页 |
| 第一章 pol-miR-26a, 26b在牙鲆性腺中的表达分析 | 第18-35页 |
| 1 实验材料 | 第18-21页 |
| ·实验用鱼 | 第18-19页 |
| ·实验试剂 | 第19页 |
| ·溶液配制 | 第19-20页 |
| ·实验仪器 | 第20-21页 |
| 2 实验方法 | 第21-29页 |
| ·总RNA提取与鉴定 | 第21-22页 |
| ·实时荧光定量qRT-PCR分析pol-miR-26a, 26b的组织表达 | 第22-26页 |
| ·原位杂交技术分析pol-mi R-26a, 26b的定位表达 | 第26-29页 |
| 3 结果 | 第29-33页 |
| ·总RNA提取质量检测 | 第29-30页 |
| ·牙鲆pol-miR-26a, 26b在不同组织中的定量表达 | 第30-31页 |
| ·牙鲆pol-miR-26a, 26b在牙鲆精巢、卵巢和脑组织中的定位表达 | 第31-33页 |
| 4 讨论 | 第33-35页 |
| 第二章 牙鲆emx2 基因的克隆和定量表达分析 | 第35-53页 |
| 1 实验材料 | 第36-37页 |
| ·实验用鱼 | 第36页 |
| ·实验试剂 | 第36页 |
| ·溶液配制 | 第36-37页 |
| 2 实验方法 | 第37-47页 |
| ·总RNA提取与鉴定 | 第37页 |
| ·牙鲆emx2 基因的cDNA片段克隆 | 第37-42页 |
| ·牙鲆emx2 基因的 3’UTR片段的克隆 | 第42-44页 |
| ·牙鲆emx2 基因的编码区和 3’UTR片段的拼接 | 第44页 |
| ·序列分析 | 第44-45页 |
| ·实时荧光定量qRT-PCR分析emx2 的表达 | 第45-47页 |
| 3 结果 | 第47-51页 |
| ·总RNA提取质量检测 | 第47页 |
| ·牙鲆emx2 cDNA小片段及 3’UTR的克隆 | 第47-49页 |
| ·牙鲆emx2 序列比对及进化树建立 | 第49-50页 |
| ·牙鲆emx2 基因在不同组织和不同发育时期的表达 | 第50-51页 |
| 4 讨论 | 第51-53页 |
| 第三章 双荧光素酶报告载体的构建及miRNA靶基因验证 | 第53-68页 |
| 1 实验材料 | 第54-55页 |
| ·细胞系 | 第54页 |
| ·实验试剂 | 第54页 |
| ·实验仪器 | 第54-55页 |
| 2 实验方法 | 第55-62页 |
| ·试剂配制 | 第55页 |
| ·293T细胞培养 | 第55页 |
| ·miRNA靶点预测 | 第55-56页 |
| ·牙鲆总RNA提取与鉴定 | 第56页 |
| ·DNase I处理刚提总RNA | 第56页 |
| ·双荧光素酶报告野生载体的构建 | 第56-58页 |
| ·双荧光素酶报告突变载体的构建 | 第58-60页 |
| ·双荧光素酶报告检测系统检测结合位点 | 第60-62页 |
| 3 结果 | 第62-66页 |
| ·miRNA靶点预测结果 | 第62-63页 |
| ·总RNA提取质量检测 | 第63页 |
| ·靶标 3’-UTR区克隆结果 | 第63页 |
| ·定点诱变结果 | 第63页 |
| ·野生型和突变型重组报告载体的鉴定 | 第63-64页 |
| ·双荧光素酶报告检测结果 | 第64-66页 |
| 4 讨论 | 第66-68页 |
| 结语 | 第68-69页 |
| 参考文献 | 第69-75页 |
| 附录 | 第75-76页 |
| 致谢 | 第76页 |
