桦褐孔菌去亚硝基酶基因的克隆与表达

【摘要】：野生桦褐孔菌可产生极具药用价值的硬毛素类多酚(多酚),但生长速度极为缓慢。人工培养可使该菌生长加快,但多酚含量极低。NO可以提高多酚的合成,但高水平NO可引起多酚合成关键酶的亚硝基化修饰(SNO-PAL)限制了多酚过量合成。硫氧还蛋白(Trx)和硫氧还蛋白还原酶(TrxR)仅在亚硝基谷胱甘还原酶(GSNOR)受抑制时才能去亚硝基化使多酚积累增加。然而,Trx/TrxR去亚硝基化作用的分子机制及GSNOR制约Trx/TrxR去亚硝基化的作用机理等尚不清楚。本课题针对以上问题进行了桦褐孔菌去亚硝基酶(Trx、TrxR、GSNOR)基因的克隆与表达,以期为多酚合成关键酶的去亚硝基化作用机理奠定基础。由桦褐孔菌全基因组序列,设计特异性引物,首次从桦褐孔菌cDNA中克隆出了三个去亚硝基酶基因,并成功构建到带有GST标签的表达载体PGEX-4T-3中,获得了带有GST标签的重组表达载体PGEX-Trx、PGEX-TrxR和PGEX-GSNOR。将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,通过IPTG诱导表达,谷胱甘肽S-转移酶亲和层析纯化和蛋白质浓度测定,分离得到带有GST标签的融合蛋白(GST-Trx、GST-TrxR和GST-GSNOR)。该研究结果为进一步验证Trx/TrxR去亚硝基化作用的分子机制及GSNOR制约Trx/TrxR去亚硝基化的作用机理奠定了基础。此外,为了进一步验证上述三种融合蛋白的催化活性,进行了体外验证模型的初步构建。通过无缝克隆技术成功构建得到重组质粒PGEX-STS、p GEX-4CL1,经IPTG诱导表达获得可溶性融合蛋白GST-STS、GST-4CL1,并对桦褐孔菌去亚硝基酶活性的验证具体方法做了详细的阐述。研究结果为该验证模型的有效实施提供了可靠的保证。
【关键词】：桦褐孔菌 去亚硝基化酶 原核表达 蛋白纯化
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：S567.3