| 致谢 | 第1-6页 |
| 摘要 | 第6-8页 |
| ABSTRACT | 第8-16页 |
| 第一章 引言 | 第16-38页 |
| ·膜蛋白的特性 | 第16-18页 |
| ·膜蛋白三维结构的研究方法 | 第18-21页 |
| ·适用于MAS ss NMR研究的膜蛋白样品制备 | 第21-36页 |
| ·膜蛋白样品制备的基本流程 | 第21-22页 |
| ·膜蛋白的超量表达 | 第22-27页 |
| ·适用于大肠杆菌表达体系的载体 | 第23-25页 |
| ·适用于膜蛋白表达的大肠杆菌宿主 | 第25-27页 |
| ·大肠杆菌表达膜蛋白条件优化 | 第27页 |
| ·膜蛋白的脂质体制备 | 第27-36页 |
| ·适用于核磁共振方法的膜模拟环境 | 第27-29页 |
| ·磷脂的特性与磷脂囊泡的制备 | 第29-32页 |
| ·去垢剂的特性与膜蛋白脂质体的制备 | 第32-36页 |
| ·本文选题意义与主要研究内容 | 第36-38页 |
| 第二章 膜蛋白样品制备与鉴定的常规方法简介 | 第38-47页 |
| ·表达载体的构建 | 第38页 |
| ·膜蛋白的表达 | 第38-42页 |
| ·表达条件 | 第39页 |
| ·表达过程 | 第39页 |
| ·高密度表达 | 第39-40页 |
| ·培养基 | 第40-42页 |
| ·膜蛋白的纯化 | 第42-43页 |
| ·亲和层析纯化(His_6-Tag) | 第42页 |
| ·凝胶过滤层析纯化 | 第42-43页 |
| ·膜蛋白的脂膜重建 | 第43-46页 |
| ·磷脂囊泡的制备 | 第43-44页 |
| ·脂膜重建条件的选择 | 第44-45页 |
| ·膜蛋白脂质体二级结构检测 | 第45-46页 |
| ·膜蛋白脂质体分辨率的检测 | 第46-47页 |
| ·1D~(15)N CP采集 | 第46页 |
| ·2D NCA和C-C相关谱采集 | 第46-47页 |
| 第三章 几个病毒孔道蛋白的表达与纯化 | 第47-73页 |
| ·引言 | 第47-48页 |
| ·EV71 2B的表达与纯化 | 第48-53页 |
| ·EV71 2B的序列信息 | 第48-49页 |
| ·表达载体的构建 | 第49-50页 |
| ·诱导温度与诱导时间的筛选 | 第50-51页 |
| ·表达菌株的优化 | 第51页 |
| ·高密度诱导表达 | 第51-52页 |
| ·纯化条件的优化 | 第52-53页 |
| ·HCV p7(1b)的表达与纯化 | 第53-59页 |
| ·HCV p7(1b)的序列信息 | 第54页 |
| ·表达载体的构建 | 第54-55页 |
| ·高密度表达 | 第55-57页 |
| ·His_6-tag的p7(1b)表达菌株与诱导温度的筛选 | 第57-58页 |
| ·His_6-tag的p7(1b)纯化条件优化 | 第58-59页 |
| ·HCV p7(5a)的表达与纯化 | 第59-63页 |
| ·HCV p7(5a)的序列信息 | 第59页 |
| ·表达载体的构建 | 第59-60页 |
| ·表达菌株与诱导温度的筛选 | 第60-62页 |
| ·高密度表达 | 第62-63页 |
| ·HIV-1 Vpu的表达与纯化 | 第63-69页 |
| ·HIV-1 Vpu的序列信息 | 第64页 |
| ·表达载体的构建 | 第64-65页 |
| ·表达菌株与诱导温度的筛选 | 第65-68页 |
| ·高密度表达 | 第68-69页 |
| ·讨论 | 第69-73页 |
| ·病毒孔道蛋白表达条件共性低 | 第69-70页 |
| ·病毒孔道蛋白表达优化流程 | 第70-71页 |
| ·His6-Tag位置可影响表达量 | 第71-73页 |
| 第四章 TEV酶切除膜蛋白融合标签MBP的研究 | 第73-85页 |
| ·引言 | 第73-74页 |
| ·材料与方法 | 第74-76页 |
| ·MrpF与TEV酶的序列信息 | 第74页 |
| ·表达载体的构建 | 第74-75页 |
| ·MBP-tagged MrpF的表达纯化 | 第75-76页 |
| ·TEV酶的表达纯化 | 第76页 |
| ·TEV酶切反应 | 第76页 |
| ·酶切位点的引入对膜蛋白表达的影响 | 第76-77页 |
| ·去垢剂对TEV酶活性的影响 | 第77-81页 |
| ·His_6-tagged GB1在去垢剂中的酶切效率 | 第77-79页 |
| ·MBP-tagged MrpF在去垢剂中的酶切效率 | 第79-81页 |
| ·空间位阻对TEV酶切效率的影响 | 第81-84页 |
| ·讨论 | 第84-85页 |
| 第五章 膜蛋白激酶DAGK结构和功能的研究 | 第85-119页 |
| ·引言 | 第85-87页 |
| ·材料与方法 | 第87-92页 |
| ·DAGK的序列信息 | 第87页 |
| ·DAGK蛋白的表达与纯化 | 第87-88页 |
| ·DAGK在DMPC/DMPG双分子层环境中脂质体的制备 | 第88-89页 |
| ·DAGK在大肠杆菌磷脂膜环境中脂质体的制备 | 第89-91页 |
| ·H/D交换实验 | 第91页 |
| ·DAGK催化活性的检测 | 第91页 |
| ·核磁谱的采集 | 第91-92页 |
| ·大肠杆菌磷脂膜中DAGK的活性检测 | 第92-95页 |
| ·DAGK活性测定 | 第92-94页 |
| ·讨论 | 第94-95页 |
| ·大肠杆菌磷脂膜中DAGK的二级结构与拓扑结构研究 | 第95-103页 |
| ·大肠杆菌磷脂膜中DAGK的二级结构与多聚体形式检测 | 第96页 |
| ·大肠杆菌磷脂膜中DAGK的信号归属 | 第96-99页 |
| ·大肠杆菌磷脂膜中DAGK水接近性氨基酸的鉴定 | 第99-100页 |
| ·大肠杆菌磷脂膜中DAGK的拓扑结构 | 第100-103页 |
| ·讨论 | 第103页 |
| ·DAGK在DMPC/DMPG中动力学的研究 | 第103-118页 |
| ·水含量对DMPC/DMPG双分子层中DAGK谱图分辨率的影响 | 第104-107页 |
| ·DMPC/DMPG双分子层中DAGK J-残基与D-残基的指认 | 第107-109页 |
| ·DMPC/DMPG双分子层中DAGK水接近性氨基酸的鉴定 | 第109-111页 |
| ·水含量对DMPC/DMPG双分子层中DAGK D-残基运动性的影响 | 第111-117页 |
| ·水含量对DMPC/DMPG磷脂相转变温度的影响 | 第111页 |
| ·水接近性对D-残基运动的影响 | 第111-113页 |
| ·水含量对D-残基在亚微秒时间尺度内运动强度的影响 | 第113-115页 |
| ·水含量对D-残基在微秒时间尺度内运动速率的影响 | 第115-117页 |
| ·讨论 | 第117-118页 |
| ·小结 | 第118-119页 |
| 第六章 总结 | 第119-121页 |
| 参考文献 | 第121-142页 |
| 附录 | 第142-154页 |
| 作者简介及在学期间发表的学术论文 | 第154页 |
