| 摘要 | 第1-5页 |
| Abstract | 第5-11页 |
| 第一章 绪论 | 第11-21页 |
| ·脂肪氧合酶的概述 | 第11-13页 |
| ·脂肪氧合酶的催化特性 | 第11页 |
| ·LOX 的来源及生理功能 | 第11-12页 |
| ·LOX 的应用 | 第12-13页 |
| ·LOX 的生产 | 第13页 |
| ·LOX 的三维结构及分子改造研究 | 第13-17页 |
| ·不同来源 LOX 的总体结构 | 第13-15页 |
| ·真核 LOX N 端β-折叠结构域的功能 | 第15页 |
| ·真核 LOX C 端α-螺旋结构域的功能 | 第15-17页 |
| ·LOX 的分子改造研究 | 第17页 |
| ·提高酶热稳定性的方法 | 第17-19页 |
| ·非理性设计 | 第17-18页 |
| ·理性设计 | 第18-19页 |
| ·立项依据及研究意义 | 第19页 |
| ·本论文的主要研究内容 | 第19-21页 |
| 第二章 P. aeruginosa LOX 基因的克隆及在 E. coli 中的分泌表达 | 第21-33页 |
| ·前言 | 第21页 |
| ·材料与方法 | 第21-24页 |
| ·菌株和质粒 | 第21页 |
| ·试剂和仪器 | 第21-22页 |
| ·培养基 | 第22页 |
| ·DNA 操作 | 第22-23页 |
| ·P. aeruginosa LOX 基因的克隆 | 第23页 |
| ·Nco I 位点的突变 | 第23页 |
| ·表达载体 pET-22b(+)/lox1 和 pET-22b(+)/slox 的构建与转化 | 第23-24页 |
| ·重组 LOX 的生产 | 第24页 |
| ·分析方法 | 第24页 |
| ·结果与讨论 | 第24-31页 |
| ·P. aeruginosa BBE LOX 基因的克隆 | 第24-25页 |
| ·表达载体 pET-22b(+)/lox1 的构建及 Nco I 位点的突变 | 第25-26页 |
| ·重组 E. coli Rosetta(DE3) (pET-22b(+)/lox1)的构建 | 第26页 |
| ·重组酶在 E. coli Rosetta(DE3) (pET-22b(+)/lox1)中的表达 | 第26-27页 |
| ·诱导温度对重组 LOX 分泌表达的影响 | 第27-28页 |
| ·诱导剂浓度对重组 LOX 分泌表达的影响 | 第28页 |
| ·信号肽对重组 LOX 分泌表达的影响 | 第28-29页 |
| ·添加物对重组 LOX 分泌表达的影响 | 第29-30页 |
| ·发酵罐条件下 E. coli Rosetta(DE3) (pET-22b(+)/lox1)诱导表达 LOX | 第30-31页 |
| ·本章小结 | 第31-33页 |
| 第三章 重组 LOX 的纯化及酶学性质研究 | 第33-43页 |
| ·前言 | 第33页 |
| ·材料与方法 | 第33-35页 |
| ·菌株 | 第33页 |
| ·培养基 | 第33页 |
| ·试剂和仪器 | 第33页 |
| ·重组酶的生产 | 第33页 |
| ·胞外重组 LOX 的分离纯化 | 第33-34页 |
| ·分析方法 | 第34-35页 |
| ·结果与讨论 | 第35-41页 |
| ·重组 LOX 的纯化 | 第35-37页 |
| ·LOX 最适反应温度和热稳定性的测定 | 第37-38页 |
| ·LOX 最适 pH 和 pH 稳定性测定 | 第38页 |
| ·金属离子及 EDTA 对 LOX 活力的影响 | 第38-39页 |
| ·LOX 产物特异性的分析 | 第39-40页 |
| ·LOX 动力学参数分析 | 第40-41页 |
| ·本章小结 | 第41-43页 |
| 第四章 缺失 N 末端高柔性 loop 提高 LOX 热稳定性 | 第43-52页 |
| ·前言 | 第43页 |
| ·材料与方法 | 第43-46页 |
| ·菌株 | 第43页 |
| ·培养基 | 第43页 |
| ·试剂和仪器 | 第43-44页 |
| ·DNA 操作 | 第44页 |
| ·突变质粒的构建与转化 | 第44-45页 |
| ·重组 LOX 的生产 | 第45页 |
| ·重组 LOX 的纯化 | 第45页 |
| ·分析方法 | 第45-46页 |
| ·结果与讨论 | 第46-50页 |
| ·野生 LOX 及缺失突变体质粒的构建 | 第46-47页 |
| ·野生 LOX 及缺失突变体的表达与纯化 | 第47-48页 |
| ·野生 LOX 及突变体的酶学性质 | 第48-49页 |
| ·圆二色谱(CD)分析野生 LOX 及突变体的二级结构 | 第49页 |
| ·荧光光谱分析野生 LOX 及突变体的三级结构 | 第49-50页 |
| ·野生 LOX 及突变体表面疏水性的分析 | 第50页 |
| ·本章小结 | 第50-52页 |
| 第五章 改造分子内部高柔性 loop 提高 LOX 热稳定性 | 第52-60页 |
| ·前言 | 第52页 |
| ·材料与方法 | 第52-54页 |
| ·菌株 | 第52页 |
| ·培养基 | 第52页 |
| ·试剂和仪器 | 第52页 |
| ·DNA 操作 | 第52-53页 |
| ·突变质粒的构建与转化 | 第53页 |
| ·重组 LOX 的生产 | 第53页 |
| ·重组 LOX 的纯化 | 第53页 |
| ·分析方法 | 第53-54页 |
| ·结果与讨论 | 第54-59页 |
| ·缺失 L6 loop 对 LOX 分泌表达及酶学性质的影响 | 第54-55页 |
| ·L6 loop 的脯氨酸突变对 LOX 分泌表达及酶学性质的影响 | 第55-56页 |
| ·PT linker 替换 L6 loop 对 LOX 分泌表达及酶学性质的影响 | 第56-57页 |
| ·圆二色谱分析野生 LOX 及突变体的二级结构 | 第57页 |
| ·稳态荧光光谱分析野生 LOX 及突变体的三级结构 | 第57-58页 |
| ·野生 LOX 及突变体表面疏水性的分析 | 第58-59页 |
| ·本章小结 | 第59-60页 |
| 第六章 N 端融合自组装双亲短肽提高 LOX 热稳定性和催化效率 | 第60-70页 |
| ·前言 | 第60页 |
| ·材料与方法 | 第60-62页 |
| ·菌株 | 第60页 |
| ·培养基 | 第60页 |
| ·试剂和仪器 | 第60页 |
| ·表达质粒的构建及转化 | 第60-61页 |
| ·重组 LOX 的生产 | 第61页 |
| ·重组 LOX 的纯化 | 第61页 |
| ·分析方法 | 第61-62页 |
| ·结果与讨论 | 第62-68页 |
| ·自组装双亲短肽的选择及融合蛋白质粒的构建 | 第62-63页 |
| ·融合蛋白的表达及纯化 | 第63-64页 |
| ·野生 LOX 及 SAP-LOX 融合蛋白的最适反应温度及热稳定性 | 第64页 |
| ·野生 LOX 及 SAP-LOX 融合蛋白的动力学参数及催化活性 | 第64-65页 |
| ·圆二色谱分析野生 LOX 及 SAP-LOX 融合蛋白的二级结构 | 第65页 |
| ·稳态荧光光谱分析野生 LOX 及 SAP-LOX 融合蛋白的三级结构 | 第65-66页 |
| ·野生 LOX 及 SAP-LOX 融合蛋白表面疏水性的分析 | 第66页 |
| ·野生 LOX 及 SAP-LOX 融合蛋白的粒径分析 | 第66-67页 |
| ·相关机理的探讨 | 第67-68页 |
| ·本章小结 | 第68-70页 |
| 主要结论与展望 | 第70-72页 |
| 论文主要创新点 | 第72-73页 |
| 致谢 | 第73-74页 |
| 参考文献 | 第74-82页 |
| 附录 | 第82页 |
