| 摘要 | 第1-7页 |
| Abstract | 第7-9页 |
| 英文缩略语 | 第9-11页 |
| 目录 | 第11-17页 |
| 第一章 绪论 | 第17-40页 |
| ·肺癌与分子靶向治疗 | 第17-23页 |
| ·肺癌 | 第17-18页 |
| ·肺癌分子靶标 | 第18-23页 |
| ·NKX2.1 基因结构及功能 | 第23-26页 |
| ·NKX2.1 基因概述 | 第23页 |
| ·NKX2.1 基因与肺癌的关系 | 第23-26页 |
| ·白细胞介素 24 | 第26-28页 |
| ·白细胞介素 24 简介 | 第26-27页 |
| ·白细胞介素 24 的抑癌作用 | 第27-28页 |
| ·RNAi 技术与腺相关病毒载体 | 第28-35页 |
| ·RNAi 的发现及技术原理 | 第28-30页 |
| ·RNAi 技术的应用 | 第30-31页 |
| ·腺相关病毒载体的研究进展 | 第31-35页 |
| ·腺相关病毒载体的生物学特性 | 第31-33页 |
| ·rAAV 在基因治疗中的应用 | 第33-34页 |
| ·AAV Helper free 系统 | 第34-35页 |
| ·关于联合治疗 | 第35页 |
| ·本论文的研究意义及技术路线 | 第35-40页 |
| ·本论文的研究意义 | 第35-36页 |
| ·本论文的技术路线 | 第36-40页 |
| 第二章 靶向 NKX2.1 基因 SIRNA 的设计及 PAAV-NKX2.1-SIRNA 质粒的构建 | 第40-64页 |
| ·引言 | 第40页 |
| ·材料与方法 | 第40-55页 |
| ·材料与试剂配制 | 第40-44页 |
| ·实验载体与菌株 | 第40页 |
| ·实验主要仪器 | 第40-41页 |
| ·实验主要试剂 | 第41-42页 |
| ·主要实验试剂及缓冲液的配制 | 第42-44页 |
| ·方法 | 第44-55页 |
| ·psiRNA-NX 质粒的构建 | 第47-52页 |
| ·pAAV-NX 质粒的构建 | 第52-55页 |
| ·结果与分析 | 第55-62页 |
| ·质粒 pAAV-NKX2.1-siRNA 的构建 | 第55-62页 |
| ·NKX2.1-siRNA 的设计结果 | 第55-58页 |
| ·NKX2.1-siRNA 克隆到 psiRNA-hH1neo 上 | 第58-59页 |
| ·H1-NKX2.1-siRNA 克隆到 pAAV-MCS 质粒上 | 第59-62页 |
| ·构建好的 pAAV-NX 质粒测序鉴定 | 第62页 |
| ·小结 | 第62-64页 |
| 第三章 携带 siRNA 的重组腺相关病毒的组装与纯化 | 第64-82页 |
| ·引言 | 第64页 |
| ·材料与方法 | 第64-73页 |
| ·材料 | 第64-66页 |
| ·实验载体与菌株、细胞 | 第64-65页 |
| ·实验主要仪器 | 第65页 |
| ·实验主要试剂 | 第65-66页 |
| ·方法 | 第66-73页 |
| ·溶液配制 | 第66-67页 |
| ·质粒提取 | 第67-68页 |
| ·质粒的纯化 | 第68-69页 |
| ·293 细胞的培养 | 第69-70页 |
| ·AAV-293 细胞生长曲线的绘制 | 第70页 |
| ·转染实验 | 第70页 |
| ·rAAV 腺相关病毒收集 | 第70-71页 |
| ·rAAV 腺相关病毒的纯化 | 第71-73页 |
| ·rAAV 滴度的测定 | 第73页 |
| ·结果与讨论 | 第73-79页 |
| ·质粒的纯化结果 | 第73-75页 |
| ·AAV-293 细胞的生长曲线绘制 | 第75-76页 |
| ·重组病毒的组装结果 | 第76-77页 |
| ·荧光显微镜检测外源基因在宿主细胞里的表达 | 第77页 |
| ·重组病毒的纯化结果 | 第77页 |
| ·重组病毒的滴度检测 | 第77页 |
| ·重组病毒颗粒的透射电镜分析及命名 | 第77-79页 |
| ·小结 | 第79-82页 |
| 第四章 RAAV-NKX2.1-SIRNA 干扰 NCI-H1975 细胞生长的研究 | 第82-96页 |
| ·引言 | 第82页 |
| ·材料与方法 | 第82-89页 |
| ·材料与仪器 | 第82-83页 |
| ·实验细胞系及抗体 | 第82页 |
| ·实验主要仪器 | 第82页 |
| ·实验主要试剂 | 第82-83页 |
| ·方法 | 第83-89页 |
| ·细胞培养 | 第83-84页 |
| ·实时荧光定量 PCR 在 mRNA 水平检测 NKX2.1 基因表达量变化 | 第84-86页 |
| ·蛋白质水平检测 NKX2.1 基因的表达量变化 | 第86-88页 |
| ·NCI-H1975 细胞增殖活性检测 | 第88页 |
| ·NCI-H1975 细胞的凋亡实验 | 第88-89页 |
| ·数据处理 | 第89页 |
| ·结果与分析 | 第89-94页 |
| ·NCI-H1975 细胞培养 | 第89页 |
| ·RT-QPCR 检测 siRNA 对 NKX2.1 基因 mRNA 的下调作用 | 第89-90页 |
| ·细胞总 RNA 的提取及电泳结果 | 第89页 |
| ·siRNA 对 NKX2.1 基因 mRNA 转录的下调效果 | 第89-90页 |
| ·Western-blot 检测 siRNA 对 NKX2.1 基因表达蛋白的抑制作用 | 第90-91页 |
| ·MTT 法检测细胞生长活性结果 | 第91-92页 |
| ·NCI-H1975 细胞的凋亡检测 | 第92-94页 |
| ·讨论 | 第94-96页 |
| 第五章 RAAV-HIL-24 干扰 NCI-H1975 细胞生长的研究 | 第96-110页 |
| ·引言 | 第96页 |
| ·材料与方法 | 第96-101页 |
| ·材料与试剂 | 第96页 |
| ·材料 | 第96页 |
| ·仪器与试剂 | 第96页 |
| ·方法 | 第96-101页 |
| ·病毒组装质粒 pAAV- hIL-24 的构建 | 第96-98页 |
| ·质粒的提取纯化及 rAAV-hIL-24 病毒的组装 | 第98页 |
| ·NCI-H1975 细胞培养与 rAAV 病毒接种感染 | 第98-99页 |
| ·RT-PCR 分析 hIL-24 在转录水平的表达 | 第99页 |
| ·Western-blot 检测 hIL-24 基因的表达 | 第99页 |
| ·NCI-H1975 细胞增殖活性检测 | 第99-100页 |
| ·NCI-H1975 细胞的细胞周期实验 | 第100页 |
| ·NCI-H1975 细胞的凋亡实验 | 第100页 |
| ·数据处理 | 第100-101页 |
| ·结果与分析 | 第101-108页 |
| ·hIL-24 基因的扩增 | 第101页 |
| ·pAAV-hIL-24 质粒的构建结果 | 第101-102页 |
| ·pAAV-hIL-24 质粒的测序鉴定 | 第102页 |
| ·RT-PCR 鉴定 hIL-24 在转录水平的表达 | 第102-103页 |
| ·Western-Blot 鉴定 hIL-24 在蛋白水平的表达 | 第103-104页 |
| ·MTT 法检测 rAAV-hIL-24 感染后细胞增殖抑制情况 | 第104页 |
| ·rAAV-hIL-24 感染 NCI-H1975 细胞后检测细胞周期抑制情况 | 第104-106页 |
| ·rAAV-hIL-24 感染 NCI-H1975 细胞后的凋亡验证 | 第106-108页 |
| ·小结 | 第108-110页 |
| 第六章 RAAV-N3-HIL-24 联合干扰肺腺癌 NCI-H1975 细胞生长的研究 | 第110-122页 |
| ·引言 | 第110页 |
| ·材料与方法 | 第110-114页 |
| ·材料与仪器 | 第110页 |
| ·方法 | 第110-114页 |
| ·病毒组装质粒 pAAV-NKX2.1- hIL-24 的构建 | 第110-112页 |
| ·质粒的提取纯化和联合表达 rAAV-N3- hIL-24 病毒的组装 | 第112页 |
| ·NCI-H1975 细胞培养 | 第112页 |
| ·NCI-H1975 细胞增殖活性检测 | 第112-113页 |
| ·NCI-H1975 细胞的凋亡实验 | 第113-114页 |
| ·数据处理 | 第114页 |
| ·结果与分析 | 第114-119页 |
| ·病毒组装质粒 pAAV-N3-hIL-24 的构建结果 | 第114-115页 |
| ·pAAV-N3-hIL-24 质粒的 PCR 鉴定 | 第115-116页 |
| ·pAAV-N3-hIL-24 质粒的双酶切 | 第116页 |
| ·pAAV-N3-hIL-24 质粒的测序验证 | 第116页 |
| ·MTT 法检测 NCI-H1975 细胞增殖抑制情况 | 第116-117页 |
| ·NCI-H1975 细胞的凋亡验证 | 第117-119页 |
| ·小结 | 第119-122页 |
| 结论与展望 | 第122-124页 |
| 1．结论 | 第122-123页 |
| 2．论文创新点 | 第123页 |
| 3．展望 | 第123-124页 |
| 参考文献 | 第124-137页 |
| 附录 | 第137-139页 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 | 第139-140页 |
| 致谢 | 第140-141页 |
| 附件 | 第141页 |
